La ligature
La ligature, processus liant de manière covalente le squelette phosphate de l'ADN double brin, est effectuée par une enzyme appelée ADN ligase. L'ADN ligase, couramment utilisée dans les laboratoires de biotechnologie, a été isolée à partir de phage T4 ou de E.coli. Elles catalysent toutes deux les réactions de ligature de manière similaire, mais elles diffèrent par leurs besoins en cofacteurs. L'enzyme E.coli a besoin de NAD+ alors que l'enzyme T4 a besoin d'ATP. Ces cofacteurs sont fournis dans le tampon.
La réaction de ligature
La réaction de ligature se compose généralement de deux étapes :
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La collision des extrémités d'ADN. Cette collision se produit par hasard et sa fréquence est plus faible à basse température. La basse température stabilise la liaison hydrogène entre les nucléotides complémentaires. L'ADN ligase atteint une activité optimale à 25o. En règle générale, plus la température d'incubation est basse, plus le temps d'incubation est long.
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La réaction enzymatique. L'ADN ligase catalyse la liaison entre le 3'-hydroxyle et le 5'-phosphate.
Réaction de ligature. Le nucléotide AMP est transféré au 5'-phosphate. Ensuite, la liaison AMP-phosphate est attaquée par le 3'-OH formant une liaison covalente tout en libérant l'AMP.
L'efficacité d'une réaction de ligature peut être augmentée en optimisant le rapport insert/vecteur. Un rapport de 3:1 est un bon paramètre de départ. La concentration du vecteur ADN et de l'insert peut être mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre tel que Nanodrop. La formule nécessaire pour calculer la quantité de gène d'intérêt (insert) à ajouter dans la réaction de ligature est la suivante :
Exemple de calcul d'optimisation de la réaction de ligature :
Données
Les résultats de la mesure au spectophomètre sont :
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Concentration du vecteur ADN : 30 ng/μL
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Concentration de l'insert : 15 ng/μL
Nous avons également des données sur la longueur du vecteur et de l'insert, qui mesurent respectivement 4 000 pb et 1 000 pb. Le rapport optimal est de 3:1. Nous utiliserons 60 ng de vecteur ADN.
Calcul
(ng du vecteur x taille en kb de l'insert) / taille en kb du vecteur x insert/vecteur = ng d'insert
- (60 ng x 1 kb) / 4 kb x 3/1 = 45 ng d'insert
| Composant de la réaction | Concentration de la réaction | Volume | ||
|---|---|---|---|---|
| Tampon de ligature 10x, ADN Ligase T4 | 1X | 20 μL / 10x = 2 μL | ||
| Vecteur ADN | 60 ng | 60 ng / 30 ng / μL = 2 μL d'insert | ||
| ADN Ligase T4 | 1 unité | 1 μL | ||
| Total | 20 μL |
Vecteur plasmidique
Le vecteur d'expression contient plusieurs sites de clonage, un agent de sélection spécifique, une origine de réplication, un opérateur et un promoteur fort. 
Les plasmides sont des molécules d'ADN extra-chromosomiques, le plus souvent à double brin, fermées de manière covalente et circulaires. Leur taille varie de 1 kb à plus de 200 kb. Tous les plasmides ne sont pas des vecteurs. Une molécule d'ADN telle que le plasmide doit avoir des caractéristiques pour pouvoir servir de vecteur pour le clonage de gènes. Il existe généralement deux types de vecteurs en fonction de leur application : le vecteur de clonage et le vecteur d'expression. Les deux vecteurs présentent les principales caractéristiques qu'un vecteur doit posséder : un gène de sélection spécifique, une origine de réplication et plusieurs sites de clonage. Mais les vecteurs d'expression ont une caractéristique supplémentaire : un promoteur fort utilisé pour exprimer une protéine étrangère codée dans le gène d'intérêt. Les vecteurs d'expression peuvent contenir un opérateur comme régulateur de l'expression génique. L'opérateur est un segment d'ADN auquel se lie un facteur de transcription. Les vecteurs de clonage sont principalement utilisés pour porter et multiplier le gène d'intérêt.
Un agent de sélection spécifique est utilisé pour s'assurer que le vecteur hôte conserve le plasmide particulier. Une origine de réplication donne au plasmide la capacité de se multiplier dans la cellule indépendamment du chromosome hôte principal.
Assemblage des plasmides
En principe, l'assemblage des plasmides comprend les étapes suivantes :
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Le plasmide vecteur circulaire fermé et le fragment du gène d'intérêt sont clivés par une ou plusieurs enzymes de restriction.
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Le gène d'intérêt est ligaturé au plasmide vecteur linéarisé.
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Le plasmide obtenu est transformé en hôte approprié.
Différentes enzymes de restriction peuvent générer des overhangs compatibles. 
On obtient un taux de réussite plus élevé dans l'assemblage des plasmides en utilisant un fragment d'ADN avec des extrémités 5' ou 3' collantes/sortantes plutôt qu'avec des extrémités franches. L'ADN ligase relie deux fragments d'ADN avec une extrémité sortante compatible. Un fragment d'ADN avec une extrémité sortante particulière peut être ligaturé non seulement au fragment qui a été découpé avec la même enzyme de restriction, mais aussi à tout fragment avec des extrémités compatibles générées par d'autres enzymes de restriction.
On peut confirmer l'assemblage des plasmides au moyen d'un séquençage de l'ADN. Il est important de confirmer la ligature de l'insert dans le vecteur plasmidique avec la bonne conformation et le bon cadre de lecture. Un déphasage du cadre peut provoquer des mutations non sens ou faux sens qui entraînent l'expression de protéines non fonctionnelles.