La spectrométrie de masse MALDI-TOF

Principe

Un spectromètre de masse est un outil d'analyse utilisé pour mesurer la masse moléculaire d'un échantillon. Les trois parties fondamentales d'un spectromètre de masse sont la source d'ionisation, l'analyseur et le détecteur. Un spectromètre de masse peut effectuer les analyses suivantes :

• La production d'ions à partir de l'échantillon dans la source d'ionisation.
• La séparation ces ions en fonction de leur rapport masse/charge dans l'analyseur de masse.
• La fragmentation des ions sélectionnés et l'analyse des fragments dans un second analyseur.
• La détection des ions sortant du dernier analyseur et la mesure de leur abondance avec le détecteur qui convertit les ions en signaux électriques.
• Le traitement des signaux du détecteur qui sont transmis à l'ordinateur et le contrôle de l'instrument par rétroaction.

MALDI

Il existe une variété de méthodes d'ionisation, mais les méthodes les plus couramment utilisées sont : l'ionisation par électronébuliseur (ESI) et la désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI). Dans ce laboratoire, nous utilisons la méthode MALDI.

La méthode MALDI, qui utilise un laser UV pour ioniser un échantillon, fonctionne selon deux étapes principales. Tout d'abord, le peptide à analyser est dissous dans une matrice, qui est un solvant contenant de petites molécules organiques. Ces molécules ont une forte absorption à la longueur d'onde du laser. Le mélange est ensuite laissé à sécher avant l'analyse. Cela entraîne la formation d'une matrice cristalline qui contient le peptide d'intérêt. Ensuite, la molécule de la matrice est excitée à un état d'énergie plus élevé lorsqu'elle rencontre le laser UV. Cela conduit finalement à la formation de l'ion d'intérêt. La molécule ionisée entre dans l'analyseur de masse et offre un spectre de masse comme résultat.

TOF

La méthode d'ionisation MALDI est couplée à un analyseur à temps de vol (TOF). Dans le TOF, on mesure le temps que mettent les ions pour atteindre le détecteur. La vitesse est déterminée par le rapport masse/charge (m/q). Les ions les plus petits atteindront le détecteur avant les plus gros, car ils ont une masse inférieure. La charge des ions détermine également la vitesse. Les ions ayant 2 charges positives ou plus se déplaceront plus rapidement que les ions ayant seulement 1 charge positive. Ainsi, les ions qui sont à la fois plus petits et chargés positivement se déplaceront plus rapidement.

Le résultat de l'analyse est le spectre de masse, affiché dans un "diagramme en bâtons". Celui-ci montre le courant relatif produit par les ions de différents rapports masse/charge.

Détection des protéines

Les protéines sont des polymères linéaires constitués par la combinaison des 20 acides aminés les plus courants, liés entre eux par des liaisons peptidiques. La protéine produite par les ribosomes subit une modification covalente appelée modification post-traductionnelle. Plus de 200 modifications ont été identifiées.

La détection de la RHuEPO (Érythropoïétine humaine recombinante) est effectuée à l'aide d'un spectromètre de masse. Le rapport masse/charge (m/q) correspond à peu près à la masse de la protéine en Dalton. Nous utilisons un échantillon d'urine pour la détection de la substance. Dans la plupart des cas, il est préférable d'utiliser un échantillon d'urine plutôt qu'un échantillon de sang pour détecter des substances interdites. En effet, le prélèvement d'urine est non invasif et permet d'obtenir un grand volume d'échantillon avec une concentration de drogues plus élevée que dans le sang. De plus, l'urine contient moins de cellules et de protéines qui compliqueraient l'extraction.

Diagramme du glycan qui comprend un bloc de construction monosaccharide

Pour détecter des substances interdites dans l'urine, nous devons d'abord réaliser un spectre standard d'urine non contaminée (standard négatif), ainsi que de la substance interdite (standard positif). Une fois que nous avons ces deux standards, nous pouvons les comparer avec le spectre d'un échantillon. Si le spectre de l'échantillon présente les mêmes pics que ceux du standard positif, nous pouvons conclure que l'échantillon contient la substance interdite. La spectrométrie de masse peut également détecter la glycosylation, car les données du spectromètre de masse sont traitées et affichées en pics. Habituellement, les pics de glycosylation sont marqués d'un astérisque ou d'un diagramme de glycanes.

Histogramme dans le laboratoire Labster

Cliquez sur le bouton bleu pour choisir les données de spectrométrie de masse de la RHuEPO exprimée dans CHO et E.coli. Il y a trois graphiques :

• Celui de gauche montre la masse totale de la molécule détectée. Les pics de ce graphique correspondent à la masse moléculaire de cette protéine particulière.

• Le graphique en haut à droite montre l'aperçu de la séquence peptidique. Les pics dans ce graphique représentent un acide aminé dans la séquence peptidique.

• Le graphique en bas à droite montre l'agrandissement de la séquence peptidique présentée dans le graphique du haut. Les pics de ce graphique représentent un acide aminé dans la séquence peptidique. Remarquez que le diagramme du glycan indique le site de la glycosylation.