La courbe de fusion

L'analyse de la courbe de fusion est utilisée pour évaluer la spécificité du test qPCR lors de l'utilisation de colorants, tels que le SYBR^®Green.

L'analyse de la courbe de fusion consiste en une étape supplémentaire à la fin de l'exécution de la qPCR. La température de l'échantillon est augmentée progressivement pendant que l'instrument continue à mesurer la fluorescence. Lorsque la température augmente, l'ADN double brin se dénature, devenant simple brin, et le colorant se dissocie, ce qui entraîne une diminution de la fluorescence. La variation de la pente de cette courbe est ensuite tracée en fonction de la température pour obtenir la courbe de fusion. La température de fusion de votre amplicon est donnée par la longueur de la séquence et sa composition en bases. Un test spécifique doit montrer de manière optimale un seul pic de fusion correspondant à un produit PCR spécifique (voir figure 1). L'analyse de la courbe de fusion vous permet de voir s'il y a un dimère d'amorce dans votre qPCR, comme indiqué par le pic à gauche du pic principal de l'amplicon dans la figure 2. Un pic après le pic principal, également observé dans la figure 2, pourrait indiquer une amplification non spécifique (par exemple, la séquence génomique de ce gène contenant un intron, ou un gène similaire appartenant à la même famille de gènes, etc).

Figure 1 : Courbe de fusion idéale

Figure 2 : Courbe de fusion avec amorce-dimère et contamination par un fragment d'ADN plus long.

L'analyse des courbes de fusion est une vérification importante pour l'analyse de vos données qPCR. .