Le séquençage de nouvelle génération
Le séquençage de nouvelle génération
Le séquençage de nouvelle génération est une technologie de séquençage avancée dans laquelle de nombreuses molécules d'ADN courtes sont séquencées simultanément. Cette technologie est également appelée séquençage massivement parallèle. Ces molécules d'ADN courtes sont ensuite assemblées en comparant leur séquence à une séquence de référence, révélant ainsi la séquence complète de l'ADN qui peut être très longue (aussi longue que notre génome !).
Il existe de nombreuses plateformes de séquençage de nouvelle génération, et chacune utilise une technique différente pour séquencer l'ADN. Dans notre cas, nous nous concentrerons sur la technologie de terminaison réversible des colorants utilisée par Illumina. Dans cette technique, l'ADN est fragmenté puis deux molécules d'ADN courtes appelées "adaptateurs" sont ligaturées à chaque extrémité de l'échantillon (voir figure 2). Ces adaptateurs feront office de sites d'amorçage pour amplifier l'ADN pendant la PCR et pour se lier à la cellule d'écoulement. Avant d'analyser les données, nous retirons les adaptateurs car ils ne constituent pas des séquences biologiques.
Les molécules d'ADN coiffées d'adaptateurs et d'amorces sont fixées sur une lame (appelée cellule d'écoulement) puis amplifiées par l'enzyme polymérase, créant des colonies d'ADN clonales locales, également appelées amas d'ADN. Chaque amas contient la même séquence d'ADN, d'où le terme colonies d'ADN clonales. Comme dans la technique de séquençage de première génération, les nucléotides sont marqués individuellement avec un colorant fluorescent. Après l'ajout d'un nucléotide, l'élongation s'arrête et une photo est prise. Ensuite, le bloqueur situé à l'extrémité 3' est retiré de l'ADN par voie chimique, ce qui permet le commencement du prochain cycle d'addition de nucléotides.
Une fois l'ADN extrait, il doit être traité en vue de son séquençage. Ci-dessous, les différentes étapes de préparation des échantillons :
- La fragmentation
- La réparation de l'ADN
- La polyadénylation
- La ligation de l'adaptateur
- L'amplification par PCR
Ces étapes sont suivies par la génération d'amas et le processus de séquençage.
Figure 1 : le flux de travail du séquençage de nouvelle génération avec la plateforme Illumina.
Le séquençage parallèle produit des milliards de lectures par cycle. Ce nombre est exponentiellement plus grand que le nombre de lectures produites par le séquençage de première génération. Le séquençage de nouvelle génération est une technique robuste utilisable dans de nombreuses applications telles que le profilage de SNP, l'analyse de l'expression génétique, et la détection des aberrations génétiques (par example, les mutations ou les réarrangements chromosomiques).
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