L'expérience NGS

Il existe plusieurs plateformes de séquençage de nouvelle génération, et chacune d'entre elles utilise une technique différente pour effectuer le séquençage de l'ADN. Dans le cas présent, nous nous concentrerons sur la technologie de terminaison réversible des colorants employée par Illumina : le séquençage par synthèse. Cela implique que les données de séquençage sont obtenues en synthétisant chaque paire de bases.

Après la génération de clusters, nous sommes prêts à commencer le processus de séquençage. Passons en revue le processus en détail.

Fixation de la polymérase

Une fois que l'amas d'ADN clonal est fixé à la cellule à flux, les réactifs de séquençage sont pompés à l'intérieur. Ils entrent d'un côté de la cellule à écoulement et sortent de l'autre côté. L'ADN polymérase T4 est injectée et se fixe aux courtes molécules d'ADN liées à la cellule à circulation.

Les 4 nucléotides sont marqués par un fluorophore spécifique. Dans l'exemple de la figure 1, la thymine est marquée par un fluorophore vert, la cytosine par un fluorophore bleu, la guanine par un fluorophore rouge et l'adénine par un fluorophore orange.

Ces nucléotides sont également modifiés : ils possèdent une coiffe en 3' qui ne permet l'ajout que d'un seul nucléotide à la fois. Par conséquent, une fois qu'un nucléotide a été ajouté à l'extrémité 3' de l'amorce, aucun autre nucléotide ne peut s'y fixer. Tous les nucléotides flottants restants sont ensuite éliminés du système par lavage.

Figure 1. Séquençage par synthèse. Après que la polymérase se soit attachée à l'amorce, des nucléotides marqués par un fluorophore spécifique sont ajoutés à l'extrémité 3' de l'amorce. Les nucléotides sont modifiés par une coiffe en 3' qui ne permet l'ajout que d'un seul nucléotide à la fois. Le signal de fluorescence émis par le fluorophore est détecté, et la coiffe 3' est clivée, ce qui permet au cycle de séquençage suivant de commencer. Nucléotides marqués par un fluorophore

Détection

Comme tous les nucléotides sont marqués individuellement avec un fluorophore spécifique, nous pouvons identifier les nucléotides en observant le signal de fluorescence qu'ils émettent. Par exemple, dans la figure 1, nous pouvons observer qu'un nucléotide marqué par un fluorophore vert a été ajouté à l'extrémité 3' de l'amorce. Une réaction chimique déclenche l'émission de la lumière verte qui peut être enregistrée en prenant une photo. Comme nous savons que la thymine est marquée par le fluorophore vert, nous pouvons identifier la base comme étant la thymine. Quatre photos sont prises à la fin de chaque cycle, enregistrant chacune des couleurs possibles. Après avoir pris les quatre photos, le système les superpose. Ainsi, nous pouvons facilement identifier l'identité de la base de chaque cluster (voir Figure 2).

Figure 2. Une image superposée, chaque point de couleur représente un amas d'ADN amplifié de façon clonale. Les codes de couleur pour les quatre nucléotides différents : Thymine, Cytosine, Guanine, et Adénine.

Cleavage et élimination

Après la prise de vue, la coiffe 3' du nucléotide est clivée afin que le cycle de séquençage suivant puisse commencer. Ceci marque la fin d'un cycle de séquençage, et le nouveau cycle peut commencer en injectant à nouveau des nucléotides fluorescents et en répétant chaque étape.

Après le séquençage, les images sont introduites dans un ordinateur et les données de séquençage peuvent être analysées avec un logiciel spécifique.