La préparation du NGS
Tout comme avec la technique de séquençage de première génération (dans le processus de séquençage d'Illumina basé sur le séquençage par synthèse), les nucléotides sont marqués individuellement avec un colorant fluorescent.
- On ajoute d'abord un nucléotide fluorescent (complémentaire de la séquence d'ADN à identifier) et l'élongation s'arrête grâce à un bloqueur sur son extrémité 3'.
- Une photo est ensuite prise pour enregistrer le colorant/nucléotide.
- Le bloqueur situé à l'extrémité 3' qui a arrêté l'élongation est chimiquement éliminé de l'ADN, ce qui permet l'ajout du nucléotide suivant.
La différence avec le séquençage de première génération est que le séquençage parallèle produit des millions de lectures par cycle, ce qui en fait une méthode beaucoup plus efficace.
Pour réaliser une expérience NGS basée sur le séquençage par synthèse, vous aurez besoin :
- D'un échantillon d'ADN modifié avec des adaptateurs.
- Des nucléotides modifiés.
- De polymérase T4.
- D'une machine de séquençage de nouvelle génération.
- De réaliser la génération de clusters.