Le processus de séquençage de nouvelle génération

Après la génération d'amas, nous sommes prêts à commencer le processus de séquençage. Il existe plusieurs façons d'effectuer le séquençage de nouvelle génération en fonction de la plateforme utilisée. Dans ce laboratoire, nous utilisons le séquençage par synthèse d'Illumina. Cela implique que les données de séquençage sont obtenues en synthétisant chaque paire de bases. Examinons ce processus.

Fixation de la polymérase

Une fois que l'amas d'ADN clonal est fixé à la lame de verre, les réactifs de séquençage sont envoyés dedans. Ils entrent d'un côté de la lame de verre et sortent de l'autre. L'ADN polymérase T4 est injectée et se fixe aux courtes molécules d'ADN liées à la lame de verre. La polymérase T4 est modifiée pour permettre l'incorporation d'une seule base.

Les 4 nucléotides sont marqués par un fluorophore spécifique. Comme vous pouvez le voir sur la figure 1, la thymine est marquée avec un fluorophore vert, la cytosine avec un fluorophore bleu, la guanine avec un fluorophore rouge et l'adénine avec un fluorophore orange. Ces nucléotides sont également modifiés : ils possèdent une coiffe à l'extrémité 3' qui ne permet l'ajout que d'un seul nucléotide à la fois. Par conséquent, une fois qu'un nucléotide a été ajouté à l'extrémité 3' de l'amorce, aucun autre nucléotide ne peut s'y fixer. Tous les autres nucléotides libres sont ensuite éliminés du système.

Figure 1 : séquençage par synthèse. Une fois que la polymérase s'est fixée à l'amorce, des nucléotides marqués par un fluorophore spécifique sont ajoutés à l'extrémité 3' de l'amorce. Les nucléotides sont modifiés par une coiffe à l'extrémité 3' qui ne permet l'ajout que d'un seul nucléotide à la fois. Le signal fluorescent émis par le fluorophore est détecté, et la coiffe à l'extrémité 3' est découpée, ce qui permet au cycle de séquençage suivant de commencer. Nucléotides marqués par un fluorophore

Détection

Comme tous les nucléotides sont marqués individuellement avec un fluorophore spécifique, nous pouvons identifier les nucléotides en observant le signal fluorescent qu'ils émettent. Par exemple, dans la figure 1, nous pouvons observer qu'un nucléotide marqué avec un fluorophore vert a été ajouté à l'extrémité 3' de l'amorce. Une réaction chimique déclenche l'émission de la lumière verte qui peut être enregistrée en prenant une photo. Comme nous savons que la thymine est marquée par le fluorophore vert, nous pouvons déterminer que la base est la thymine. Quatre photos sont prises à la fin de chaque cycle et enregistrent chacune des couleurs possibles. Après avoir pris les quatre photos, le système les superpose. Ainsi, nous pouvons facilement identifier la base de chaque amas (voir figure 2).

Figure 2 : une image superposée, chaque point de couleur représente un amas d'ADN amplifié de façon clonale. Les codes de couleur pour les quatre nucléotides différents : thymine, cytosine, guanine et adénine.

Clivage et élimination

Après la photo, la coiffe à l'extrémité 3' du nucléotide est découpée afin que le cycle de séquençage suivant puisse commencer. La coiffe 3' clivée est ensuite retirée du système. Cela marque la fin d'un cycle de séquençage, et le nouveau cycle peut commencer en envoyant de nouvelles séries de nucléotides et en répétant les étapes.

Après le séquençage, les images sont introduites dans un ordinateur et les données de séquençage peuvent être analysées avec un logiciel spécifique.