Amplification par PCR

PCR (Réaction en chaîne par polymérase)

La PCR est une méthode utilisée pour préparer des milliards de copies de séquences d'ADN spécifiques. Il est souvent nécessaire d'avoir un plus grand nombre de copies de la séquence d'ADN spécifique que celui que l'on trouve dans un échantillon type pour analyser la séquence de paires de bases ou la longueur de l'ADN. En outre, la réaction PCR est hautement spécifique, ce qui signifie qu'elle ne produira que des copies de la séquence souhaitée à partir de l'ADN matrice (échantillon). Cette spécificité est assurée par les amorces, qui sont conçues pour être complémentaires et s'hybrider à des régions spécifiques de chaque côté de la région d'ADN concernée (région cible). Ces caractéristiques font de la PCR une technique puissante à utiliser, par exemple, dans le génotypage de marqueurs, avant le séquençage ou dans divers tests ADN.

*La PCR comporte trois étapes : 1. Dénaturation, 2. Hybridation et 3. Extension. Ces étapes sont répétées de nombreuses fois (souvent 30) et produisent des milliards de copies d'ADN de régions spécifiques.

Les étapes de la PCR

Pour préparer des milliards de copies d'ADN, de nombreux cycles répétés de synthèse d'ADN sont effectués dans un tube PCR. Chaque cycle comprend trois étapes distinctes définies par la température (figure 1). Tous les cycles sont réalisés sans intervention dans une machine PCR, qui peut changer automatiquement la température pour créer les étapes.

1. L'étape de dénaturation (95 ºC) : à cette température élevée, les liaisons hydrogène qui maintiennent ensemble les deux brins d'ADN sont rompues, et les brins d'ADN se désagrègent. L'ADN monocaténaire peut maintenant être copié.
2. L'étape d'hybridation (54 ºC) : à 54 °C, de courts morceaux d'ADN appelés amorces se lient aux sites complémentaires de l'ADN matrice. Les amorces définissent la séquence cible, c'est-à-dire la région spécifique de l'ADN qui sera copiée. La température d'hybridation est calculée à partir de la composition des amorces (le nombre de nucléotides ainsi que le nombre de guanine et de cytosine). Normalement, il faudrait calculer la température d'hybridation optimale pour chaque amorce. Dans ce cas, on considère que 54 °C est la température optimale.
3. L'étape d'extension (72 ºC) : à 72 ºC, une enzyme appelée ADN polymérase est responsable de la copie de l'ADN. Elle reconnaît l'extrémité 3′ d'une amorce liée à un brin matrice et commence à copier l'ADN matrice.

À la fin d'un cycle, des parties des brins d'ADN initiaux ont été doublées en nombre. Par exemple, à la fin des 30 cycles habituellement effectués dans la PCR, au moins 1 milliard (2³⁰) de copies de la séquence cible seront présentes dans le tube. Pour effectuer une PCR, vous devez ajouter une ADN polymérase thermostable, des nucléotides, des amorces et l'ADN que vous voulez utiliser comme matrice.

Les réactifs de la PCR

• Les amorces : les amorces se fixent sur une séquence d'ADN spécifique et marquent le début de l'amplification de l'ADN.
• Les nucléotides : les nucléotides sont nécessaires pour construire la nouvelle séquence d'ADN.
• La polymérase : la polymérase est une enzyme qui assemble les nucléotides sur la base de la séquence matrice.
• L'ADN matrice : une matrice est nécessaire pour servir de base à l'amplification de la nouvelle séquence d'ADN.

Lorsque vous préparez une expérience de PCR, vous devez faire très attention aux contaminations potentielles. La PCR est une technique très puissante permettant d'amplifier l'ADN. Cela signifie qu'en cas de petite contamination (par exemple, de l'ADN provenant d'un autre échantillon), cet ADN peut également être amplifié, entrer en compétition avec le modèle original et détruire les résultats de votre expérience. Pour éviter toute contamination, vous devez toujours utiliser des gants et travailler dans un environnement très propre (changez les embouts de pipette lorsque vous prélevez de l'ADN dans un autre récipient, attachez vos cheveux, ne toussez pas et n'éternuez pas à proximité du plan de travail de la PCR, etc.)