Les expériences de PCR

Pour préparer des milliards de copies d'ADN, de nombreux cycles répétés de synthèse de l'ADN sont effectués dans un tube PCR. Chaque cycle comprend trois étapes distinctes qui sont définies par la température (voir la figure ci-dessous) :

1. L'étape de dénaturation (95 ºC) : à cette température élevée, les liaisons hydrogène qui maintiennent ensemble les deux brins d'ADN sont brisées et les brins d'ADN se désagrègent. L'ADN monocaténaire transcrit est maintenant disponible pour effectuer une copie.

2. L'étape d'hybridation des amorces (5-10 ºC en dessous de l'amorce ayant le Tm le plus bas) : à la température d'hybridation, de petits brins d'ADN appelés "amorces" se lient aux sites complémentaires de l'ADN qui sert de matrice. Les amorces définissent la séquence cible, qui est la région spécifique de l'ADN qui sera copiée. La température de l'hybridation est calculée à partir de la composition de l'amorce (le nombre de nucléotides ainsi que le nombre de guanines et de cytosines). Normalement, vous devez calculer la température d'hybridation optimale pour chaque amorce.

3. L'étape d'élongation (72 ºC) : à 72 ºC, une enzyme appelée ADN polymérase est responsable de la copie de l'ADN. Elle reconnaît l'extrémité 3′ d'une amorce liée à un brin matrice et commence à copier l'ADN matrice. Dans ce cas, il s'agit d'une polymérase thermostable, car elle doit être active à la température élevée qui est utilisée.

Tous les cycles sont effectués sans intervention, dans une machine PCR qui peut changer la température automatiquement après chaque étape. À la fin d'un cycle, les brins d'ADN initiaux ont été doublés en nombre. À la fin de 30 cycles, qui est le nombre de cycles effectué habituellement lors de la PCR, au moins 1 milliard (2³⁰) de copies de la séquence cible seront présentes dans le tube.

Expérience de PCR : la PCR se compose de trois étapes : 1. La dénaturation 2. L'hybridation des amorces 3. L'élongation

Ces étapes sont répétées de nombreuses fois (souvent pas moins de 30 fois). Elles produisent ainsi des milliards de copies d'ADN pour certaines régions spécifiques.