La préparation de la PCR
Voici ce qu'il vous faudra pour réaliser une expérience de PCR :
- Des amorces
- Des nucléotides
- De l'ADN polymérase
- De l'[ADN matrice
- Des précautions particulières pour éviter les contaminations
- Un thermocycleur
Si l'un de ces composants est manquant, aucune réaction ne se produira et aucun ADN ne sera synthétisé.
Les mélanges-maîtres contiennent la plupart des composants de la PCR (à l'exception de la matrice d'ADN) en plus grande quantité par rapport à la quantité de réactions PCR que nous souhaitons effectuer. Vous pouvez réduire la marge d'erreur et la variabilité de l'expérience et gagner du temps en préparant des mélanges-maîtres.
Ils contiennent généralement les amorces directes et inverses spécifiques, les nucléotides (dNTP), l'enzyme Taq polymérase et éventuellement du MgCl2, de l'eau sans nucléase et un tampon de réaction.
Les amorces : Les amorces se fixent sur une séquence d'ADN spécifique et marquent le début de l'amplification de l'ADN. La conception des amorces est très importante pour amplifier avec succès la région d'intérêt. Elles définissent la longueur du produit PCR en limitant ses extrémités.
Les nucléotides : Les nucléotides sont nécessaires pour synthétiser la nouvelle séquence d'ADN. Ce sont les blocs de construction de l'ADN.
La polymérase : La polymérase est l'enzyme qui assemble les nucléotides à partir de la séquence matrice. La Taq polymérase est l'ADN polymérase la plus utilisée dans les expériences de PCR.
La matrice d'ADN : un brin d'ADN matrice est nécessaire pour servir de base à l'amplification d'une nouvelle séquence d'ADN. Effectuez l'isolement de l'ADN pour extraire l'ADN des cellules.
Attention aux contaminations : Lorsque vous préparez une expérience de PCR, vous devez faire très attention aux contaminations potentielles. La PCR est une technique très efficace pour amplifier l'ADN. Cela signifie que même en cas de petite contamination (par exemple, de l'ADN provenant d'autres échantillons), cet ADN risque également d'être amplifié, entrant ainsi en compétition avec le modèle original et détruisant les résultats de votre expérience. Pour éviter toute contamination, vous devez toujours utiliser des gants et travailler dans un environnement stérile (par exemple, changez les embouts de pipette lorsque vous pipettez à partir d'un autre récipient, attachez vos cheveux, ne toussez et n'éternuez pas autour du plan de travail PCR).