L'amplification par PCR

La PCR est une méthode utilisée pour préparer des milliards de copies de séquences spécifiques d'ADN.

En général, pour analyser la séquence ou la longueur de l'ADN, il faut un plus grand nombre de copies de la séquence d'ADN spécifique que celui que l'on trouve dans un échantillon typique. En outre, la réaction PCR est hautement spécifique, ce qui signifie qu'elle ne produira que des copies d'une séquence souhaitée à partir de la matrice (échantillon d'ADN). Cette spécificité est assurée par les amorces, qui sont conçues pour être complémentaires et s'hybrider à des régions spécifiques de chaque côté de la région d'ADN concernée (région cible). Ces caractéristiques font de la PCR une technique puissante à utiliser, par exemple, dans le génotypage de marqueurs, avant le séquençage, ou dans divers tests d'ADN.

Figure 1 : La PCR se compose de trois étapes : 1. la dénaturation, 2. l'hybridation, et 3. l'élongation. Ces étapes sont répétées de nombreuses fois (souvent 30), produisant des milliards de copies d'ADN de régions spécifiques.

Les étapes de la PCR

Pour préparer des milliards de copies d'ADN, de nombreux cycles répétés de synthèse d'ADN sont effectués dans un tube PCR. Chaque cycle comprend trois étapes distinctes définies par la température (figure 1). Tous les cycles sont réalisés sans intervention dans une machine PCR, qui peut changer la température automatiquement après chaque étape.

1. L'étape de dénaturation (95 ºC) : à cette température élevée, les liaisons hydrogène qui maintiennent ensemble les deux brins d'ADN sont rompus et les brins d'ADN se désagrègent. L'ADN simple brin est maintenant disponible pour être copier.
2. L'étape de l'hybridation (54 ºC) : à 54 °C, de courts morceaux d'ADN appelés amorces se lient aux sites complémentaires de l'ADN matrice. Les amorces définissent la séquence cible, qui est la région spécifique de l'ADN qui sera copiée. La température de l'hybridation est calculée à partir de la composition de l'amorce (le nombre de nucléotides ainsi que le nombre de guanine et de cytosine). Normalement, vous devriez calculer la température de l'hybridation optimale pour chaque amorce. Dans ce cas, nous considérons que 54 °C est la température d'hybridation pour toutes les amorces.
3. L'étape d'élongation (72 ºC) : à 72 ºC, une enzyme appelée ADN polymérase est responsable de la copie de l'ADN. Elle reconnaît l'extrémité 3′ d'une amorce liée à un brin matrice et commence à copier l'ADN matrice.

À la fin d'un cycle, des parties des brins d'ADN initiaux ont été doublées en nombre. Au bout de 30 cycles, par exemple, généralement effectués dans le cadre de la PCR, au moins 1 milliard (2³⁰) de copies de la séquence cible seront présentes dans le tube. Pour effectuer une PCR, vous devez ajouter une ADN polymérase thermostable, des nucléotides, des amorces et l'ADN que vous voulez utiliser comme matrice.

Les réactifs PCR

Plusieurs réactifs sont nécessaires pour réaliser une expérience de PCR :

• Les amorces : les amorces se lient à une séquence d'ADN spécifique et marquent le début de l'amplification de l'ADN.
• Les nucléotides : des nucléotides sont nécessaires pour construire la nouvelle séquence d'ADN
• La polymérase : la polymérase est une enzyme qui assemble les nucléotides sur la base de la séquence matrice
• L'ADN matrice : un modèle est nécessaire pour servir de base à l'amplification d'une nouvelle séquence d'ADN

Lorsque vous préparez une expérience de PCR, vous devez faire très attention à la contamination potentielle. La PCR est une technique très puissante pour amplifier l'ADN. Cela signifie que si vous avez une petite contamination (par exemple, de l'ADN provenant d'autres échantillons), cet ADN peut également être amplifié, entrant en compétition avec le modèle original et détruisant les résultats de votre expérience. Pour éviter toute contamination, vous devez toujours utiliser des gants et travailler dans un environnement très propre (changez les embouts de pipette lorsque vous pipettez à partir d'un autre récipient, attachez vos cheveux, ne toussez pas et n'éternuez pas autour du plan de travail PCR, etc.).

Comme nous l'avons décrit ci-dessus, une erreur provenant d'une expérience de PCR peut facilement fausser le résultat. C'est pourquoi nous devons minimiser la probabilité d'erreur de la PCR, en particulier lorsque nous poursuivons avec une autre technique extra-sensible telle que le séquençage de nouvelle génération. En général, l'étape de PCR dans le séquençage de nouvelle génération ne comprend que 10 à 12 cycles. Les erreurs créées lors de l'étape de PCR se traduisent par des désaccords dans l'alignement des données de séquençage de nouvelle génération, en particulier les erreurs des premiers cycles de PCR qui se traduisent par des lectures multiples, suggérant à tort une variation génétique dans l'échantillon.