La réaction de polymérisation en chaîne (PCR)

La réaction de polymérisation en chaîne, généralement abrégée PCR (de l'anglais : polymerase chain reaction ) est une méthode utilisée pour préparer des milliards de copies de séquences d'ADN spécifiques. Il est souvent nécessaire d'avoir un plus grand nombre de copies de la séquence d'ADN spécifique que celui que l'on trouve dans un échantillon type pour analyser la séquence ou la longueur de l'ADN. En outre, la réaction PCR est hautement spécifique, ce qui signifie qu'elle ne produira que des copies de la séquence souhaitée à partir de l'ADN matrice (échantillon). Cette spécificité est assurée par les amorces, qui sont conçues pour être complémentaires et s'hybrider à des régions spécifiques de chaque côté de la région d'ADN concernée (région cible). Ces caractéristiques font de la PCR une technique puissante à utiliser, par exemple, dans le génotypage de marqueurs, avant le séquençage ou dans divers tests ADN.

Figure 1. La PCR est composée de trois étapes : 1. Dénaturation, 2. Hybridation et 3. Élongation. Ces étapes sont répétées de nombreuses fois (souvent 30) et produisent des milliards de copies d'ADN de régions spécifiques.

Les étapes de la PCR

Pour préparer des milliards de copies d'ADN, de nombreux cycles répétés de synthèse d'ADN sont effectués dans un tube PCR. Chaque cycle comprend trois étapes distinctes définies par la température (figure 1). Tous les cycles sont réalisés sans intervention dans une machine PCR, qui peut modifier automatiquement la température pour créer les étapes.

L'étape de dénaturation (95 ºC) : à cette température élevée, les liaisons hydrogène qui maintiennent ensemble les deux brins d'ADN sont rompues et les brins d'ADN se désagrègent. L'ADN monocaténaire peut maintenant être copié.
L'étape d'hybridation (54 ºC) : à 54 °C, de courts morceaux d'ADN appelés amorces se lient aux sites complémentaires de l'ADN matrice. Les amorces définissent la séquence cible, c'est-à-dire la région spécifique de l'ADN qui sera copiée. La température d'hybridation est calculée à partir de la composition des amorces (le nombre de nucléotides ainsi que le nombre de guanine et de cytosine). Normalement, il faudrait calculer la température d'hybridation optimale pour chaque amorce. Dans ce cas, on considère que 54 °C est la température optimale.
L'étape d'élongation (72 ºC) : à 72 °C, une enzyme appelée ADN polymérase est responsable de la copie de l'ADN. Elle reconnaît l'extrémité 3′ d'une amorce liée à un brin matrice et commence à copier l'ADN matrice.

À la fin d'un cycle, des parties des brins d'ADN initiaux ont été doublées en nombre. Par exemple, à la fin des 30 cycles habituellement effectués dans la PCR, au moins 1 milliard (2³⁰) de copies de la séquence cible seront présentes dans le tube. Pour effectuer une PCR, vous devez ajouter une ADN polymérase thermostable, des nucléotides, des amorces et l'ADN que vous voulez utiliser comme matrice.

Les réactifs de la PCR

Plusieurs réactifs sont nécessaires pour mener une expérience de PCR.

Amorces : les amorces se lient à une séquence d'ADN spécifique et marquent le début de l'amplification de l'ADN.
Nucléotides : les nucléotides sont nécessaires pour créer la nouvelle séquence d'ADN.
Polymérase : la polymérase est une enzyme qui assemble les nucléotides sur la base de la séquence matrice.
ADN matrice : une matrice est nécessaire pour servir de base à l'amplification d'une nouvelle séquence d'ADN.

Lorsque vous préparez une expérience de PCR, vous devez faire très attention aux contaminations potentielles. La PCR est une technique très puissante pour amplifier l'ADN. Cela signifie qu'en cas de petite contamination (par exemple, de l'ADN provenant d'un autre échantillon), cet ADN peut également être amplifié, entrer en compétition avec le modèle original et détruire les résultats de votre expérience. Pour éviter toute contamination, vous devez toujours utiliser des gants et travailler dans un environnement très propre (changez les embouts de pipette lorsque vous prélevez dans un récipient différent, attachez vos cheveux, ne toussez pas et n'éternuez pas à proximité du plan de travail de la PCR, etc.).

Conception d'amorces pour le clonage direct

Afin de créer des produits PCR qui peuvent être clonés directement sur un plasmide, il est nécessaire d'ajouter un site de restriction aux deux extrémités du produit PCR. L'ajout de ces sites de restriction peut être effectué en utilisant une paire d'amorces avec un site de restriction spécifique ajouté à l'extrémité 5'. Chaque amorce contient un site de restriction à l'extrémité 5' et un site d'hybridation à l'extrémité 3'. Consultez le tableau des sites de restriction pour choisir le bon site de restriction. Le site de restriction choisi doit répondre aux exigences suivantes :

Enzymes de restriction qui ne coupent pas dans le gène RAD52.
Enzymes de restriction qui coupent seulement dans le SCM (site de clonage multiple) du plasmide cible.
Enzymes de restriction qui ont les mêmes conditions optimales de tampon et de température.

Suivez les étapes suivantes pour créer une amorce :

Amorce sens

Choisir 18-22 pb au début de la séquence du gène d'intérêt (vérifier que les exigences d'une bonne amorce sont satisfaites).
Ajouter la séquence du site de restriction à l'extrémité 5'.

Amorce antisens

Choisir 18-22 pb à la fin de la séquence du gène d'intérêt (vérifier que les exigences d'une bonne amorce sont satisfaites).
Compléter en sens inverse la séquence choisie.
Ajouter la séquence des sites de restriction à l'extrémité 5'.

L'isolement de l'ADN

L'électrophorèse sur gel

Aperçu de la théorie