La méthode phénol-chloroforme pour l'isolement des acides nucléiques

Les acides nucléiques des cellules peuvent être isolés à l'aide de la méthode phénol-chloroforme. Le phénol-chloroforme est un mélange de phénol saturé de tampon et de chloroforme dans un rapport de 1:1. Les étapes de la procédure sont les suivantes :

1. La lyse et l'homogénéisation en solution aqueuse. Ceci est fait avec un tampon de lyse et en mélangeant l'échantillon par vortex.

2. L'ajout de phénol-chloroforme au lysat et le mélange par vortex.

3. La centrifugation permet de séparer les phases en fonction de leur densité. Le phénol a une densité de 1,07 g/cm³ alors que le chloroforme a une densité plus élevée (1,47 g/cm³). Ils forment donc deux phases : la phase organique inférieure (phénol-chloroforme) et la phase aqueuse supérieure (voir image ci-dessous). Les acides nucléiques gagnent en polarité grâce à leur squelette phosphate de charge négative ; ils sont donc solubles dans la phase aqueuse supérieure. Les protéines contiennent des régions hydrophobes qui interagissent avec le phénol et provoquent la précipitation des protéines à l'interface entre les deux phases (souvent sous forme de floculation blanche). Les lipides ont également une région hydrophobe et se dissolvent dans la phase organique inférieure. Le pH du mélange détermine la séparation des acides nucléiques. À pH neutre, l'ARN et l'ADN sont retenus dans la phase aqueuse supérieure, mais à pH acide, l'ADN se déplace vers la phase organique inférieure et l'ARN reste dans la phase aqueuse supérieure.

4. La récupération des acides nucléiques. Dans la dernière étape, les acides nucléiques sont récupérés de la phase aqueuse par précipitation à l'aide d'isopropanol.

La méthode d'extraction à l'aide du phénol-chloroforme est utilisée pour l'isolement des acides nucléiques.