L'extraction des plasmides par miniprep
Il existe plusieurs méthodes différentes pour purifier l'ADN plasmidique des cellules bactériennes. La miniprep est une méthode d'isolement rapide et à petite échelle, qui repose sur la lyse alcaline des cellules, suivie de la purification de l'ADN sur une colonne de silice.
Les étapes suivantes doivent être réalisées pour purifier les plasmides d'une culture bactérienne :
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Réduisez les cellules en fragments en les centrifugeant à 10 000 tours/minute pendant 3 minutes.
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Homogénéisez les cellules en ajoutant un tampon d'homogénéisation et en pipettant à plusieurs reprises.
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Lysez les cellules avec un tampon de lyse (contenant un détergent) et en inversant le tube à plusieurs reprises.
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Lysez les cellules pendant un maximum de 5 minutes à température ambiante.
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Arrêtez la réaction en ajoutant un tampon de neutralisation et en inversant le tube à plusieurs reprises. Des amas blancs apparaîtront : ce sont les débris des cellules.
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Réduisez les fragments en les centrifugeant pendant 10 minutes à 13 000 tours/minute. Au final, votre plasmide sera dans le surnageant (la phase liquide).
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Appliquez le surnageant sur la colonne de silice et centrifugez à 13 000 tours/minute pendant 1 min. Votre plasmide se fixera sur le filtre au bas de la colonne. Jetez le liquide qui s'écoule.
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Lavez votre ADN deux fois avec un tampon de lavage (ajoutez, centrifugez, jetez).
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Centrifugez pendant 1 minute sans rien ajouter pour éliminer tout tampon résiduel.
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Transférez votre colonne dans un tube propre de 1,5 ml et ajoutez le tampon d'élution (eau avec 10 mM de Tris_HCl). Laissez-le sur votre plan de travail pendant quelques minutes avant de recommencer la centrifugation.
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Vérifiez les concentrations d'ADN dans la nano-goutte.