Les enzymes de restriction
Les enzymes de restriction coupent la chaîne sucre-phosphate de l'ADN bicaténaire. Elles reconnaissent un site spécifique de l'ADN bicaténaire et le coupent à l'intérieur ou à proximité de leur site de reconnaissance. L'activité optimale de chaque enzyme de restriction est affectée par des conditions telles que la température, le pH, le cofacteur enzymatique, la composition saline et la force ionique.
Les conditions de réaction
La température d'incubation affecte grandement l'activité de l'enzyme de restriction. En général, le temps d'incubation reflète la température de croissance de la souche bactérienne d'où elle provient. La plupart des enzymes de restriction ont une température optimale de 37 °C et un pH optimal de 7,2 ou 8,5. Ces conditions d'environnement physique doivent être respectées pour que l'enzyme atteigne son activité maximale. En dehors des conditions physiques souhaitables, l'enzyme peut se dénaturer. Les enzymes fonctionnent de manière très spécifique ; par conséquent, elles ne fonctionneront pas bien si leur structure se détériore. Étant donné que chaque enzyme de restriction est isolée de différentes bactéries et que ses conditions de réaction optimales sont différentes, elle nécessite un tampon spécifique qui est utilisé pour chaque réaction de restriction.
Les types d'enzymes de restriction
Les enzymes de restriction peuvent être divisées en 4 groupes en fonction de leur séquence de reconnaissance, de la composition de leurs sous-unités, de leur position de clivage et de leurs besoins en cofacteurs. Les différences essentielles sont résumées dans le tableau 1.
Tableau 1. Les types d'enzymes de restriction
| Types | Caractéristiques |
|---|---|
| Type I | Le système d'enzymes de restriction de type I se compose d'une enzyme avec différentes sous-unités pour la reconnaissance, le clivage et la méthylation. Cette enzyme reconnaît et méthyle la même séquence, mais coupe l'ADN jusqu'à 1 000 paires de bases du site de reconnaissance initial. |
| Type II | L'enzyme de restriction de type II associe deux enzymes différentes, qui coupent ou modifient la séquence de reconnaissance. |
| Type III | Le système d'enzymes de restriction de type III est constitué d'une enzyme avec deux sous-unités différentes, chacune pour la reconnaissance et la modification ou le clivage. Cette enzyme reconnaît et méthyle la même séquence, mais coupe à 24-26 paires de bases du site de reconnaissance initial. |
| Type IIs | Le système d'enzymes de restriction de type IIs est composé de deux enzymes différentes avec une séquence de reconnaissance asymétrique. Le clivage se produit d'un côté du site de reconnaissance jusqu'à 20 paires de bases de distance. |
Le type d'enzymes de restriction le plus utile qui a été vendu dans le commerce est l'enzyme de restriction de type II. Comme elle est constituée de deux enzymes différentes, il est possible de couper l'ADN sans modification. De plus, l'activité de l'enzyme de restriction de type II ne nécessite pas de cofacteur tel que l'ATP ou la S-adénosylméthionine.
Séquence de reconnaissance des enzymes de restriction
La plupart des enzymes de restriction de type II reconnaissent et coupent l'ADN dans une séquence spécifique de 2 à 8 nucléotides, qui est palindromique. Une séquence palindromique signifie que la séquence de bases nucléotidique se lit de la même manière à l'envers (sens 3' vers 5') et à l'endroit (sens 5' vers 3'). Les enzymes de restriction de type II produisent trois extrémités différentes :
a) Extrémité franche
Ce type d'enzyme coupe précisément au même site dans les deux brins d'ADN, ce qui génère des fragments d'ADN à extrémités franches sans saillies.
b) Extrémité 5' collante
Ce type d'enzyme coupe de manière asymétrique dans le site de reconnaissance, de sorte qu'un court segment monocaténaire s'étende à partir des extrémités 5'.
c) Extrémité 3' collante
Ce type d'enzyme coupe de manière asymétrique dans le site de reconnaissance, de sorte qu'un court segment monocaténaire s'étende à partir des extrémités 3'.
Tableau 2. La reconnaissance des enzymes de restriction
| Enzyme | Séquence de reconnaissance | Extrémités |
|---|---|---|
| HindIII | A/AGCTT | Extrémités 5' collantes |
| BglI | GCCNNNN/NGGC | Extrémités 3' collantes |
| EcoRI | G/AATTC | Extrémités 5' collantes |
| BamHI | G/GATCC | Extrémités 5' collantes |
| EcoRV | GAT/ATC | Extrémités franches |
| SalI | G/TCGAC | Extrémités 5' collantes |
| FaeI | CATG/ | Extrémités 3' collantes |
| KpnI | GGTAC/C | Extrémités 3' collantes |
| XhoI | C/TCGAG | Extrémités 5' collantes |
| DpnI | GA/TC | Extrémités franches |
| SmaI | CCC/GGG | Extrémités franches |
| XbaI | T/CTAGA | Extrémités 5' collantes |