PCR à transcription inverse

Tous les gènes ne sont pas constamment exprimés dans toutes les cellules. Une cellule doit transcrire la séquence d'ADN en ARNm afin de produire la protéine codée. Par conséquent, le niveau d'expression des gènes correspond au niveau d'ARNm. L'expression des gènes peut être mesurée à l'aide d'une réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse (RT-PCR). La RT-PCR comprend les étapes suivantes :

• Conversion de l'ARN en ADNc à l'aide de la transcriptase inverse.

• Amplification de l'ADNc par PCR

Figure 1. Étapes de la création d'ADNc à partir d'une matrice d'ARNm. En utilisant une amorce Oligo(dT), l'ARNm est transcrit de façon inverse en ADNc, suivi par l'hydrolyse du brin d'ARN.

L'ARNm est plus fragile que l'ADN et ne peut être amplifié par PCR. C'est pourquoi l'ARNm est converti en ADN complémentaire (ADNc). L'ADNc est un ADN synthétisé à partir de molécules d'ARN messager. La synthèse de l'ADNc est catalysée par une enzyme appelée transcriptase inverse, qui utilise l'ARN comme modèle pour la synthèse de l'ADN. La transcriptase inverse a été initialement découverte et isolée à partir d'un rétrovirus. Ces virus contiennent un génome d'ARN ; ils doivent donc produire une copie d'ADNc de leur génome pour être compatibles avec la machinerie moléculaire de la cellule hôte.

La réaction de RT-PCR comprend les étapes suivantes :

• Un fragment oligo(T) est utilisé comme amorce afin de se lier à la queue poly(A) 3' de chaque ARNm.

• La transcriptase inverse utilise l'ARN comme matrice pour synthétiser les brins d'ADNc.

• L'hybride ARN-ADNc résultant est séparé en augmentant la température.

• Une amorce spécifique au gène s'annule à sa séquence complémentaire.

• L'ADN polymérase produit le brin d'ADN complémentaire, en partant du site de liaison de l'amorce.

• Les brins sont séparés en augmentant la température et le cycle de PCR est répété.

À la fin de la réaction de RT-PCR, il y aura des milliards de copies du gène d'intérêt si celui-ci a été exprimé. La quantité de copies d'ADN peut être visualisée par électrophorèse sur gel.