La quantification des acides nucléiques

Pour l'analyse de quantification, la spectrophotométrie est recommandée. Cette technique vous fournit des informations sur la concentration en acide nucléique de votre échantillon ainsi que deux rapports de qualité, 260/280 et 260/230. Pour obtenir des informations sur l'intégrité de l'ARN, d'autres techniques doivent être appliquées.

Le rapport 260/280 reflète la pureté de l'ADN et de l'ARN. À 260 nm, on mesure les acides nucléiques et à 280, les protéines. Le rapport 260/280 recommandé doit être compris entre 1,8 et 2,1. Si le rapport est inférieur, cela peut indiquer la présence de protéines ou d'autres contaminants qui absorbent à 280 nm.

Le rapport 260/230 est utilisé comme mesure secondaire de la pureté des acides nucléiques. À 260 nm, vous mesurez les acides nucléiques et à 230, vous mesurez les produits chimiques restant dans votre échantillon après l'étape d'isolement. Les valeurs 260/230 doivent être comprises entre 2,0 et 2,2. Si le rapport est plus faible que prévu, cela peut indiquer la présence de contaminants, qui absorbent à 230 nm (par exemple, le phénol).

Mesure par spectrophotomètre.

La concentration des acides nucléiques peut être déterminée en mesurant leur absorbance à l'aide d'un spectrophotomètre tel que le Nanodrop.

L'absorbance est mesurée à 260nm (A260) où les acides nucléiques absorbent la lumière le plus fortement. La quantité de lumière absorbée est proportionnelle à la quantité d'acides nucléiques dans l'échantillon.

La relation entre la concentration et l'absorbance est décrite par la loi de Beer-Lambert : A = c * ε * L, qui peut également être écrite comme c = A / (ε * L), avec

• c : la concentration d'acide nucléique en molaire.

• A : l'absorbance en AU.

• ε : le coefficient d'extinction molaire dépendant de la longueur d'onde (également appelé absorptivité molaire) en molaire/cm.

• L : la longueur du trajet en cm (pour NanoDrop, cette valeur est de 10 mm).

Cette image représente la sortie d'une quantification spectrophotométrique de l'ARN d'un échantillon d'ARN de haute qualité.