Le processus de séquençage

Maintenant que nous avons une cellule d'écoulement remplie d'ADN, nous pouvons commencer le processus de séquençage. Il existe plusieurs façons d'effectuer un séquençage de nouvelle génération en fonction de la plate-forme que vous utilisez. L'une d'elles est le séquençage par synthèse dans lequel les données de séquençage sont obtenues en synthétisant chaque paire de bases.

Figure 1 : le séquençage par synthèse. Une fois que la polymérase s'est fixée à l'amorce, des nucléotides marqués par un fluorophore spécifique sont ajoutés à l'extrémité 3' de l'amorce. Les nucléotides sont modifiés par une coiffe 3' qui ne permet l'ajout que d'un seul nucléotide à la fois. Le signal de fluorescence émis par le fluorophore est détecté et la coiffe 3' est clivée, ce qui permet au cycle de séquençage suivant de commencer.

La fixation de la polymérase

Une fois que l'amas d'ADN clonal s'est fixé à la cellule d'écoulement, les réactifs de séquençage sont envoyés dans la cellule d'écoulement, en entrant d'un côté et en sortent de l'autre. L'ADN polymérase T4 est introduite et se fixe à la molécule d'ADN courte liée à la cellule d'écoulement (qui sert d'amorce de séquençage).

Les nucléotides marqués par un fluorophore

Chacun des quatre nucléotides est marqué par un fluorophore spécifique. Par exemple, la thymine est marquée par un fluorophore vert, la cytosine par un fluorophore bleu, la guanine par un fluorophore rouge et l'adénine par un fluorophore orange. Ces nucléotides sont également modifiés. Leur coiffe 3' ne permettant l'ajout que d'un seul nucléotide à la fois, une fois qu'un nucléotide a été ajouté à l'extrémité 3' de l'amorce, aucun autre nucléotide ne peut s'y fixer. Les nucléotides libres restants sont ensuite éliminés du système.

La détection par fluorophores

Étant donné que tous les nucléotides sont marqués individuellement par un fluorophore spécifique, nous pouvons identifier les nucléotides en observant le signal de fluorescence qu'ils émettent. Par exemple, dans la figure 1, nous pouvons voir qu'un nucléotide marqué par un fluorophore vert est ajouté à l'extrémité 3' de l'amorce. Une réaction chimique déclenche l'émission de la lumière verte qui peut être capturée en prenant une photo. Comme nous savons que la thymine est marquée par le fluorophore vert, nous pouvons identifier la base comme étant la thymine. Quatre photos sont prises à la fin de chaque cycle, enregistrant chacune des couleurs possibles. Après avoir pris les quatre photos, le système les superpose, de sorte que nous pouvons identifier rapidement l'identité de base de chaque amas.

Le clivage et l'élimination

Après la prise de la photo, la coiffe 3' du nucléotide est séparée pour que le cycle de séquençage suivant puisse commencer. La coiffe 3' clivée est ensuite éliminée du système. Cela marque la fin d'un cycle de séquençage et le nouveau cycle peut commencer par le nettoyage de nouvelles séries de nucléotides et la répétition des étapes.

En savoir plus : - Le séquençage simple et le séquençage à extrémité appariée