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Le principe de la spectrophotométrie

Le spectrophotomètre est réglé pour ne mesurer qu’une certaine longueur d’onde. Cette longueur d’onde peut être ajustée pour mesurer de façon optimale le composé spécifique. Le spectrophotomètre affiche l’absorbance (A) qui est calculée à l’aide de la formule log(It/I0). Avec I0 l’intensité de la lumière incidente et It l’intensité de la lumière qui traverse la solution et qui est mesurée par le spectrophotomètre. Il existe entre l’absorbance et la concentration une relation linéaire décrite ci-dessous par la loi de Beer-Lambert :

A = log (I0 / It) = ε • c • l

où c est la concentration de la solution, l la longueur de la solution (que la lumière doit traverser) et ε est le coefficient d’extinction spécifique à un composé. [1]

Un spectrophotomètre comprend les éléments ci-dessous (figure 1) :

  • Une source de lumière

  • Un sélecteur de longueur d’onde

  • Un récipient d’échantillon (par exemple, une cuvette)

  • des transducteurs de rayonnement

  • un détecteur

Le trait noir commence à la source de lumière présentée sous la forme d’une ampoule et passe par la pointe d’une pyramide bleue appelée monochromateur. Ensuite, le même trait maintenant appelé I zéro devient horizontal et passe à travers un trait noir épais vertical appelé ouverture réglable. Derrière l’ouverture, on place un rectangle aligné verticalement appelé cuvette qui contient une solution verte appelée échantillon. Le trait zéro I passe à travers la cuvette et l’échantillon, changeant de nom en I, et s’arrête sur une structure elliptique appelée photorésistance. La photorésistance est connectée à un autre triangle appelé amplificateur, qui à son tour est connecté à un rectangle jaune à l’intérieur duquel est affichée la valeur 0,260 A.

Figure 1 : La lumière émise par la source passe à travers la fente, qui ne laisse passer qu’une certaine longueur d’onde. Cette lumière va traverser l’échantillon qui se trouve dans une cuvette et sera mesurée par le détecteur.

On mesurera par exemple les concentrations de NADH qui a un maximum d’absorption de 340 nm. Le spectrophotomètre est alors réglé pour mesurer cette longueur d’onde. On calcule le coefficient d’extinction du NADH à l’aide de la formule suivante : ε=6220 M-1cm-1. La longueur de la solution est généralement fixée à 1 cm.

Le chercheur doit tenir compte de certaines insuffisances de la loi de Beer-Lambert. Certaines sont d’ordres techniques. Cependant, la principale insuffisance de cette loi, c’est qu’elle ne s’applique qu’aux solutions diluées. Lorsque la concentration d’une espèce absorbante augmente, la fréquence des interactions physico-chimiques entre molécules augmente également. Par conséquent, à une concentration donnée, les molécules commencent à avoir une incidence sur la répartition des charges des molécules environnantes. La relation entre l’absorbance et la concentration n’est alors plus linéaire. En règle générale, il faut rester en dessous d’une valeur d’absorption de 1 pour les mesures.

Il faut savoir que l’absorbance est inversement proportionnelle à la transmittance (consulter le manuel pour de plus amples détails). Pour une valeur d’absorbance de 1, 10 % de la lumière émise est transmise à travers l’échantillon. Pour une valeur de 2, 1 % de la lumière est transmise, et ainsi de suite suivant une constante logarithmique.

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La spectrophotométrie