La courbe d'étalonnage

Pour une bonne interprétation des résultats de la qPCR, l'efficacité de la réaction PCR revêt une grande importance. Elle dépend de l'analyse, de la performance du master mix et de la qualité de l'échantillon. Elle se calcule à partir d'une courbe d'étalonnage.

Une courbe d'étalonnage est réalisée à partir de plusieurs réactions qPCR, sur une série de dilutions x10 d'ADN. La série de dilution peut être réalisée à partir d'un groupe d'échantillons d'ADNc que vous allez tester, dilués successivement 10 fois. Pour construire une courbe d'étalonnage, il faut tracer les valeurs Ct obtenues pour chaque dilution (partie supérieure de la figure ci-dessous) en fonction du logarithme des facteurs de dilution (FD) utilisés pour réaliser la courbe d'étalonnage. La courbe d'étalonnage est alors la ligne de régression passant par ces points (partie inférieure de la figure ci-dessous, côté gauche). La pente de la ligne de régression est liée à l'efficacité de l'amplification par la formule de la figure ci-dessous. En général, une efficacité comprise entre 80 et 110 % est considérée comme acceptable. À 100 %, vous doublez la quantité de produit à chaque cycle de votre réaction PCR. Vous pouvez également utiliser la ligne de régression pour déterminer la concentration d'échantillons inconnus à partir de leurs valeurs Ct.