La transformation (la technique biotechnologique)

La transformation est une technique importante utilisée pour insérer de l'ADN exogène dans une cellule hôte. L'une des nombreuses techniques de transformation des cellules est l'électroporation. C'est une méthode de transformation mécanique qui utilise une impulsion électrique pour créer des pores temporaires dans la membrane cellulaire. Ces pores permettent à la molécule d'ADN de passer la membrane cellulaire et de pénétrer dans la cellule. Le site haute tension de l'électricité entraîne la formation de pores hydrophobes dans la membrane membrane cellulaire d'environ 2 nm.

Paramètre de l'électroporation

• La tension

La condition électrique de l'électroporation pour chaque micro-organisme varie. Par exemple, la levure, telle que Saccharomyces cerevisiae, présente un état électrique optimal de 40 μl de cellule, 1,5 kV pendant environ 5 ms.

• La cellule

Les cellules électro-compétentes sont utilisées pour augmenter l'efficacité de l'électroporation. l'efficacité de l'électroporation. La compétence est la capacité d'une cellule à absorber l'ADN extracellulaire ("nu") de son environnement. extracellulaire ("nu") de son environnement. Les cellules de levure sont rendues électrocompétentes en les lavant dans une solution non ionique pour éliminer tous les sels. en veillant à ce que la charge ne soit pas conduite dans le milieu. Le site L'électroporation optimale pour la levure est obtenue en utilisant des levures en phase mi-logarithmique ou tardive. ou de la fin de la phase logarithmique. La phase logarithmique de la levure peut être divisée en trois parties :

• La phase logarithmique précoce : la période où les densités cellulaires sont d'environ 10⁷ cellules/ml.
• La phase logarithmique moyenne : les cultures ont des densités comprises entre 1 et 5 × 10⁷ cellules/ml.
• La phase logarithmique tardive : se produit lorsque les densités cellulaires sont comprises entre 5 × 10⁷ et 2 × 10⁸ cellules/ml.

En phase logarithmique, le taux de croissance est rapide et le taux de division cellulaire dépasse le taux de mort cellulaire. division cellulaire dépasse le taux de mort cellulaire. Les cellules sont métaboliquement actives et ont une réplication du génome suffisante pour effectuer une réparation efficace de l'ADN. Ainsi, les cellules à cette phase peuvent tolérer des traitements sévères comme l l'électroporation.

• L'ADN

La fréquence de transformation augmente avec la concentration d'ADN dans le tampon d'électroporation. Mais veuillez noter que trop de concentration d'ADN concentration d'ADN peut également réduire l'efficacité de la transformation. Le site concentration exacte d'ADN doit être déterminée pour chaque expérience.

• Le milieu d'électroporation

Afin d'éviter la formation d'un arc électrique pendant l'électroporation, il est important de laver soigneusement la cellule électrocompétente afin d'éliminer le milieu de croissance de l'échantillon. la cellule électrocompétente afin d'éliminer le milieu de croissance de la cellule. de la cellule. Le lavage peut être effectué avec de l'eau ou avec une solution non ionique comme le glucose, le glycérol, le saccharose, le sorbitol ou le polyéthylèneglycol. La présence d'un matériau ionique peut provoquer un arc électrique pendant l'électroporation.

Le sorbitol est utilisé de préférence parce qu'il agit comme un cryoprotecteur non perméable qui réduit de manière significative les risques de contamination. cryoprotecteur non perméable qui réduit considérablement les dommages à la membrane cellulaire pendant la décongélation. Les dommages à la membrane réduisent significativement l'efficacité de l'efficacité de la transformation.

Pendant la procédure d'électroporation, la température augmente et les cellules subissent des lésions membranaires causées par l'influx rapide d'eau. cellules subissent des lésions membranaires causées par l'afflux et l'efflux rapides d'eau dus aux l'efflux d'eau rapide dû au non-équilibre osmotique extracellulaire et intracellulaire. non-équilibre osmotique. Ce type de lésion peut être prévenu par un stabilisateur stabilisateur osmotique tel que le sorbitol. Ainsi, le sorbitol agit comme un cryoprotecteur et un osmorégulateur.

La diffusion

L'étalement désigne une méthode permettant de répartir les bactéries de manière uniforme sur la surface d'une plaque de gélose. Un petit volume de culture microbienne est microbienne est étalé uniformément sur la surface de la gélose à l'aide d'un étaleur en verre. Procédure d'étalement :

• L'étaleur en verre doit être stérilisé en utilisant la chaleur de la flamme du brûleur Bunsen d'un brûleur Bunsen. Tout d'abord, trempez l'étaleur en verre dans de l'alcool (70% d'éthanol), secouez-le pour l'éliminer. éthanol), secouez l'excès d'alcool et enflammez le résidu. Ensuite, laissez refroidir l'épandeur.
• Répartissez uniformément la culture microbienne sur la surface de la plaque de support. La pression est appliquée uniformément lorsque le verre est étalé sur la surface de la plaque. surface.
• Laissez la culture microbienne être absorbée par la plaque.
• Incuber la plaque à l'envers pour éviter la formation de gouttelettes d'eau (condensation) sur la plaque. (condensation) sur la plaque.

Il est important de choisir une seule colonie pour isoler des clones génétiques purs. Une colonie est un groupe de cellules qui proviennent de la même source ; par conséquent, toutes les cellules d'une seule colonie contiennent des informations génétiques identiques. génétique identique.

La sélection des antibiotiques

Le milieu utilisé dans le clonage moléculaire est un milieu riche qui favorise la croissance microbienne. Des milieux sélectifs peuvent être utilisés pour éviter toute confusion lors de la sélection entre les colonies transformées et les colonies non transformées. A milieu sélectif est préparé en ajoutant des antibiotiques tels que l'ampicilline, l'hygromycine, un dérivé de la zéocine et de la bléomycine, et la kanamycine. L'antibiotique utilisé doit correspondre au gène de résistance aux antibiotiques codé dans un vecteur plasmidique. vecteur plasmidique, c'est-à-dire que si un vecteur plasmidique contient un gène de β-lactamase (gène de résistance à l'ampicilline), alors l'ampicilline doit être utilisée. ), alors l'ampicilline doit être utilisée comme agent sélectif.

Les microbes qui ont été transformés contiennent le gène de résistance aux antibiotiques gène de résistance aux antibiotiques codé dans le vecteur plasmidique. L'antibiotique permet de sélectionner les colonies transformées parmi les colonies non transformées. colonies non transformées. Parce que les colonies transformées expriment certaines protéines nécessaires pour résister à l'effet de l'antibiotique, elles peuvent survivre dans le milieu contenant l'antibiotique alors que les colonies non transformées ne le peuvent pas.

L'efficacité d'un système de résistance aux antibiotiques particulier est influencée par :

• L'agent sélectif (antibiotique).

Il doit inhiber complètement la croissance non transformée.

• Le gène de résistance.

Il doit exprimer la protéine nécessaire pour résister complètement à l'effet de l'agent sélectif. effet. Le niveau d'expression du gène de résistance peut être contrôlé par des signaux de contrôle transcriptionnels et translationnels qui lui sont utilisés.

• Le matériel à sélectionner.

Dans ce cas, le matériel à sélectionner est constitué de cellules de microbes. Les cellules microbiennes doivent être sensibles à l'effet des antibiotiques.

L'ampicilline est couramment utilisée pour la sélection bactérienne. Cependant, les levures Cependant, la levure n'est pas sensible à l'ampicilline ; elle ne peut donc pas être utilisée comme agent sélectif pour le criblage de transformation de la levure. pour le dépistage de la transformation de la levure. L'un des nombreux antibiotiques qui qui peuvent être utilisés pour le criblage de la transformation de la levure est la zéocine. La zéocine fait partie des antibiotiques de type bléomycine/phléomycine isolés de Streptomyces. La zéocine provoque la mort cellulaire en liant et en clivant l'ADN à l'intérieur de la cellule. Le gène Sh ble (Streptoalloteichus encode la protéine de résistance à la zéocine hindustanus bleomycin gene). Cette protéine se lie à la zéocine de manière stœchiométrique, provoquant l'inhibition de l'activité de clivage du brin d'ADN de la zéocine. de la zéocine.