L'extraction au thiocyanate de guanidium-phénol-chloroforme

Une méthode couramment utilisée pour isoler l'ARN complet est l'extraction au thiocyanate de guanidium-phénol-chloroforme. Cette méthode utilise un produit chimique appelé réactif TRI (ou TRIzol), qui contient de l'isothiocyanate de guanidinium, un puissant dénaturant de protéines, et du phénol, un solvant organique. Le tampon du réactif TRI maintient l'intégrité de l'ARN, perturbe les cellules et dénature les protéines. Cette méthode est basée sur les recherches de Piotr Chomczynski et Nicoletta Sacchi en 1987 et 2006. Elle prend un peu plus de temps que les méthodes sur colonne comme RNAeasy (Qiagen), mais elle peut traiter de plus grandes quantités de tissus ou de cellules et donne donc plus d'ARN.

$Un tube à essai avec des fractions étiquetées de lysat d'ARN après centrifugation. On peut voir deux couches distinctes de liquide dans le tube à essai, la couche du fond du tube est rouge et étiquetée comme étant la phase organique qui contient des protéines et des lipides. La couche supérieure est claire et appelée phase aqueuse, elle contient l'ARN. La surface entre les phases est appelée l'interphase, qui contient l'ADN.$

Les principales étapes de l'isolement de l'ARN sont les suivantes:.

La lyse cellulaire et la perturbation des structures cellulaires.
La séparation de l'ARN des débris cellulaires.
La purification de l'ARN de l'ADN et des protéines.
La précipitation de l'ARN.
Le lavage et la remise en suspension de l'ARN.

Le lysat est composé d'ARN, d'ADN, de protéines et de débris cellulaires. La centrifugation peut être utilisée pour séparer les macromolécules (protéines, ARN et ADN) des débris cellulaires. La séparation des phases de l'échantillon se produira lorsque du chloroforme sera ajouté à l'échantillon, en fonction des différentes densités. En outre, le pH déterminera la séparation des acides nucléiques et des protéines. L'ARN polaire restera dans la phase polaire supérieure, l'ADN s'accumulera dans l'interphase et les protéines dénaturées se dissoudront dans la phase organique inférieure.

L'ARN de la phase aqueuse est précipité en ajoutant de l'isopropanol, qui précipite les molécules polaires comme les ARN et les sels. Les sels peuvent être lavés avec de l'éthanol à 75 % pour obtenir de l'ARN pur. Enfin, le culot d'ARN est séché et remis en suspension en utilisant de l'eau exempte de RNAse comme tampon.

Après l'isolement de l'ARN, la concentration et la pureté de l'ARN doit être évaluée. La qualité doit également être inspectée avant toute analyse ultérieure.

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