La détection des protéines à l'aide d'anticorps

La détection des protéines d'intérêt est rendue possible par l'utilisation d'anticorps spécifiques. Avant d'appliquer les anticorps sur la membrane, une solution de blocage, généralement de l'albumine de sérum bovin (ASB) à 5 % ou du lait en poudre dégraissé, est ajoutée pour empêcher la liaison non spécifique des protéines.

En général, deux anticorps sont utilisés dans le western blot : les anticorps primaires et les anticorps secondaires. Les anticorps primaires ont un site de liaison unique qui peut reconnaître des protéines spécifiques. Une fois la membrane incubée avec les anticorps primaires et les anticorps primaires non liés éliminés par lavage, on ajoute les anticorps secondaires. Les anticorps secondaires se lient sélectivement aux anticorps primaires. Les anticorps secondaires servent non seulement de support au marqueur de détection mais aussi d'amplificateur du signal émis. Le marqueur fixé aux anticorps secondaires est généralement une biotine ou une enzyme rapporteur telle que la phosphatase alcaline (AP) ou la peroxydase de raifort (HRP).

Figure 1 : détection des protéines à l'aide d'anticorps.

De nombreuses variétés d'anticorps secondaires avec différents systèmes de marquage sont disponibles dans quatre systèmes de détection : colorimétrique, chimiluminescence, radioactif et fluorescent.

Comme pour toutes les expériences, il est important d'ajouter un témoin expérimental. Dans le cas du western blot, cela permet de vérifier si une quantité similaire d'échantillon a été ajoutée et donc de s'assurer que les résultats sont comparables. Le témoin le plus courant est l'actine. Cette protéine est exprimée à des niveaux élevés dans toutes les cellules et peut être visualisée de manière fiable sur un western blot.