La préparation des échantillons pour le western blot

Différentes méthodes de préparation des échantillons sont possibles selon qu'une protéine est extracellulaire ou intracellulaire. Les protéines intracellulaires sont plus difficiles à extraire et la procédure doit être conçue avec soin.

Figure 1 : la préparation d'un échantillon pour le western blot.

La composition cellulaire de chaque organisme est un mélange complexe de molécules comprenant des protéines, des acides nucléiques, des polysaccharides et du sel. Ces molécules peuvent interférer avec la méthode western blot, d'où l'importance de la préparation de l'échantillon. Il existe de nombreuses méthodes de broyage cellulaire qui permettent de préparer l'échantillon pour le western blot. En général, lorsqu'il s'agit de cellules de mammifères, vous pouvez éliminer la membrane cellulaire par lyse détergente, lyse par congélation/décongélation, ou par homogénéisation mécanique et sonication.

Après l'extraction, l'échantillon de protéines est bouilli dans une solution qui contient un colorant de repérage (bleu de bromophénol), un agent réducteur de disulfure (bêta-mercaptoéthanol) et un détergent (dodécylsulfate de sodium / SDS). L'ébullition dénature la protéine, ce qui la déplie. Le bêta-mercaptoétanol empêche la reformation des liaisons disulfure et ainsi perturbe les structures quaternaires et tertiaires de la protéine, créant des polypeptides à chaîne linéaire. Le dodécylsulfate de sodium confine la protéine avec une charge négative.