Résolution des problèmes du western blot
Bulles d'air
Causées par le fait de ne pas placer le gel et la membrane sur la pile avec suffisamment de précautions ou par l'élimination inadéquate des bulles d'air avec un rouleau ou une carte en plastique. La bulle d'air crée une poche où il n'y a pas de tampon et donc pas de conductivité. L'échantillon ne sera pas transféré du gel à la membrane dans cette zone et la membrane aura l'air d'avoir de petites zones vides bien définies lorsqu'elle sera colorée avec le colorant Ponceau S.
Mauvaise conductivité
L'électricité étant conduite par les ions du tampon, un trempage insuffisant peut entraîner des zones de mauvaise conductivité. Ces zones ont tendance à être plus grandes et moins bien définies que celles causées par les bulles d'air.
Surchauffe
L'expérience peut surchauffer s'il y a une résistance accrue due à une très mauvaise conductivité ou à un manque de refroidissement. Le premier cas est causé par un trempage insuffisant dans le tampon, le second par l'absence de la poche de glace pendant le transfert. La membrane peut alors brûler ou le gel fondre. Dans les zones où le gel a fondu, il n'y aura pas de transfert de protéines et ces zones apparaîtront blanches lorsque la membrane sera colorée avec du Ponceau S.
Mauvaise direction de la migration
Les protéines migrent de la cathode vers l'anode. Le gel doit donc être orienté vers l'anode et la membrane vers la cathode. Si la pile est assemblée dans le mauvais ordre ou si la cassette de transfert est insérée dans la cuve dans le mauvais sens, les protéines pourraient être transférées dans la direction du papier filtre au lieu de la direction de la membrane. Lorsqu'elle est colorée avec du Ponceau S, la membrane apparaît blanche.
Couches non alignées
Si les couches ne sont pas alignées correctement ou ne sont pas maintenues suffisamment serrées, elles peuvent bouger pendant l'expérience. Cela se traduira par des bandes moins bien définies sur la membrane lorsqu'elle sera colorée avec du Ponceau S.
Mauvaise orientation
Les protéines sont chargées sur le gel de SDS-PAGE dans un certain ordre. Si le gel est tourné ou retourné pendant l'étape de transfert, les échantillons peuvent être mélangés. Pour éviter cela, le gel ne doit pas être symétrique. On peut y parvenir en coupant un coin. Il peut également être utile de marquer la membrane avec un stylo à bille.