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La résolution des problèmes liés à la coloration de Gram

La coloration de Gram est une procédure délicate qui nécessite de faire particulièrement attention aux moindres détails. Une préparation de frottis et des techniques de coloration inadéquates produisent souvent des résultats erronés.

La préparation du frottis

  • Le frottis bactérien : si le frottis est appliqué en couche trop épaisse, les bactéries à Gram négatif apparaissent plus foncées et pourraient être confondues avec les bactéries à Gram positif.
    Essayez de toujours appliquer une seule couche de l’organisme que vous voulez étudier.

  • La fixation : si les bactéries sont trop chauffées pendant la fixation, la paroi cellulaire sera détruite et les bactéries ne seront plus capables de retenir le cristal violet.
    Toutes les bactéries apparaîtront par conséquent comme étant des bactéries à Gram négatif.

  • Le frottis d’une ancienne culture : si le frottis d’une culture est trop vieux, la paroi cellulaire bactérienne pourrait déjà avoir été détruite, ce qui les rendrait incapables de retenir la coloration au cristal violet. Toutes les bactéries apparaîtraient par conséquent comme étant des bactéries à Gram négatif.

La décoloration

La décoloration produit souvent des résultats erronés lors de la coloration de Gram.

  • La sous-décoloration : si l’alcool (décolorant) est éliminé par lavage avant d’avoir eu un effet sur la paroi cellulaire, les molécules de cristal violet ne s’échappent pas de la paroi cellulaire à Gram négatif. Par conséquent, toutes les bactéries apparaissent comme étant à Gram positif (violet) après une contre-coloration à la safranine.

  • La sur-décoloration : laisser de l’alcool (décolorant) sur la lamelle trop longtemps perturbe la paroi cellulaire des bactéries à Gram positif et à Gram négatif.
    Les bactéries à Gram positif ne peuvent pas retenir le cristal violet, et par conséquent, toutes les bactéries apparaissent comme étant à Gram négatif (roses) après une contre-coloration avec la safranine.
    La première image présente le résultat de la sous-décoloration. Deux structures en forme de haricot, représentant des cellules bactériennes, sont colorées en violet. Une flèche bleue part de chacune d’elles vers deux sections transversales de la paroi cellulaire, l’une pour les bactéries gram positives, l’autre pour les bactéries gram négatives. Dans les deux structures, même si elles diffèrent l’une de l’autre, des molécules violettes de cristal violet sont présentes, ainsi que des sphères orange représentant l’iode. La deuxième image présente le résultat d’une sur-décoloration. Deux structures en forme de haricot, représentant des cellules bactériennes, sont décolorées. Une flèche bleue part de chacune d’elles vers deux sections transversales de la membrane cellulaire interne, l’une pour les bactéries gram positives, l’autre pour les bactéries gram négatives. Dans les deux structures, les molécules violettes de cristal violet et les molécules orange d’iode flottent au-dessus de la membrane et ne sont pas piégées à l’intérieur.

Figure 1 : Exemples de sous-décoloration et de sur-décoloration.