Assemblaggio 3A
L'assemblaggio di tre antibiotici (Assemblaggio 3A) è un metodo per assemblare due BioBricks tramite la clonazione degli enzimi di restrizione. Tre diverse resistenze antibiotiche consentono una efficiente selezione dei corretti assemblaggi degli antibiotici. L'assemblaggio 3A utilizza i siti di restrizione sul prefisso e sul suffisso per assemblare le due parti.
Un'efficace selezione antibiotica elimina la necessità di utilizzare la purificazione del gel e colonie PCR delle risultanti colonie. In teoria, circa il 97% delle colonie dovrebbero garantire l'assemblaggio desiderato.
Metodo
Per ottenere un corretto assemblaggio hai bisogno di due parti e di una spina dorsale con geni aventi differenti resistenze antibiotiche (rappresentate dalle frecce gialle nella figura 1).
Figura 1: Assemblaggio 3A (crediti: iGEM.org)
-
-
La parte sinistra del campione viene tagliata con EcoRI (E) e SpeI (S).
-
La parte destra del campione viene tagliata con XbaI (X) e PstI (P):
-
La spina dorsale del plasmide viene tagliata con EcoRI (E) e PstI (P). Nell'esempio nella figura 1 è stato utilizzata una spina dorsale linearizzata di un plasmide. In alternativa può essere utilizzato un plasmide costituito da un gene ccdB.
-
-
Tutte e 3 le digestioni da restrizione sono riscaldate per eliminare tutti gli enzimi di restrizione.
-
Ligazione: Una quantità equimolare di tutti e 3 i prodotti delle digestioni da restrizione sono combinate in una reazione di ligazione. Il risultato desiderato è la sporgenza SpeI del campione della parte sinistra ligata alla sporgenza XbaI del campione della parte destra con conseguente cicatrice che non può essere tagliata con nessuno dei nostri enzimi. Il nuovo campione della parte composita viene ligato nella spina dorsale del plasmide di costruzione nei siti EcoRI e PstI.
-
Quando la ligazione viene trasformata in cellule e coltivata sulle piastre contenenti l'antibiotico C, riusciranno a sopravvivere solamente le colonie con la costruzione corretta.