Ligazione dell'adattatore

Come già spiegato nella sezione dedicata all'adenilazione, lo scopo dell'aggiunta di adenina all'estremità del filamento di DNA è di permettere specifici abbinamenti con la coda di timina dell'adattatore.

L'adattatore è un breve frammento complementare di DNA a doppio filamento (vedi figura sotto). Un filamento ha una coda a T all'estremità 3', che corrisponde alla sporgenza A sul DNA e assicura che uno dei due filamenti dell'adattatore (qui in blu e arancione) sarà presente all'estremità di ciascun filamento del campione di DNA.

Funzioni degli adattatori

Gli adattatori svolgono delle funzioni importanti nell'ambito della tecnologia Next Generation Sequencing:

Primer: gli adattatori fungono da sito di ancoraggio universale dei primer per l'amplificazione PCR. Dal momento che non conosciamo la sequenza del nostro campione di DNA (infatti è proprio questo lo scopo del sequenziamento), non possiamo progettare dei primer specifici per la PCR. Gli adattatori forniscono, in questo caso, un modello noto per tutti i diversi filamenti di DNA. Perciò abbiamo bisogno di usare solo 2 set di primer per essere in grado di amplificare tutte le diverse piccole molecole di DNA nel campione.

Ancoraggio alla cella di flusso: gli adattatori aiutano inoltre queste molecole di DNA ad ancorarsi/attaccarsi alla cella di flusso nel macchinario di sequenziamento. La cella di flusso è ricoperta da tante brevi molecole di DNA che sono complementari alla sequenza dell'adattatore. Quando le molecole di DNA vengono pompate nella cella di flusso, gli adattatori si legheranno in modo specifico a queste brevi molecole di DNA fisse. Ciò è fondamentale per la generazione dei cluster.