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Campione di DNA antico

Il DNA antico si riferisce al DNA estratto da campioni antichi, come materiali scheletrici, tessuti mummificati o altri campioni che non sono stati conservati specificamente per ulteriori analisi del DNA.

Il DNA antico è interessante da studiare perché può fornire l'accesso a un punto evolutivo del passato. Il DNA può essere estratto da quasi tutte le cellule. Tuttavia il DNA antico avrà subito una certa degradazione a causa dell'esposizione alla temperatura, all'acqua e ad altri fattori. Più vecchio è il campione di DNA, più danni avrà probabilmente subito ma, grazie ai recenti progressi nella tecnologia di analisi, anche il DNA antico può essere analizzato usando il Next Generation Sequencing. A causa dei danni presenti il numero di cicli in una PCR è solitamente limitato. Ad ogni ciclo c'è la possibilità che vengano introdotti errori.

Le caratteristiche comuni del DNA antico sono le seguenti: (a) rotture del singolo filamento, (b) legami incrociati, e (c) modifica ossidativa e idrolitica delle basi.

Tre pannelli. Il pannello superiore mostra la struttura chimica di 3 basi di DNA collegate tramite gruppi fosfato. L'idrolisi è etichettata e le frecce puntano dalle basi del DNA alle viste di esse spezzate e separate in componenti chimici più piccoli. Le frecce partono da questi componenti e puntano a del testo che indica poche molecole modello o alla breve lunghezza del frammento. Le frecce poi puntano al testo che indica la contaminazione o i prodotti brevi della PCR. Il secondo pannello mostra l'alchilazione o la reazione di Maillard con una freccia che indica i collegamenti incrociati tra i filamenti corrispondenti di una molecola di DNA. Un'altra freccia indica i crosslink intermolecolari che mostrano i collegamenti tra un filamento di DNA e una molecola di DNA separata o una proteina. Entrambe le situazioni portano alla non amplificazione e alla contaminazione. Il terzo pannello è etichettato come ossidazione e idrolisi. La freccia dall'ossidazione indica le lesioni bloccanti in una struttura chimica che finiscono per saltare le sequenze PCR e chimeriche. La freccia dell'idrolisi indica le lesioni da codifica sbagliata in cui un atomo di una base viene sostituito con un altro atomo creando una mancata incorporazione di basi ed errori di sequenza.

Figura 1. Le caratteristiche comuni del DNA antico sono le seguenti: (a) rotture di singoli filamenti, (b) legami incrociati, e (c) modifica ossidativa e idrolitica delle basi. (Willerslev, E. e Cooper, A., 2005, Proc.R.Soc.B, 272,3-16)

Caratteristiche del DNA antico

I campioni di DNA antico condividono alcune caratteristiche, causate dal danno che hanno subito. Identificando queste caratteristiche, possiamo riconoscere una sequenza di DNA antico da una sequenza di DNA moderno e contaminante (per esempio, il campione di DNA di un individuo che non ha maneggiato correttamente il campione prima dell'analisi in laboratorio). Di seguito sono riportate alcune delle caratteristiche del DNA antico che vengono normalmente utilizzate in un'analisi di Next Generation Sequencing.

  • Danni idrolitici

I danni idrolitici sono responsabili di danni nella spina dorsale dello zucchero; potrebbero portare a rotture di un singolo filamento o alla perdita di basi del DNA. Quando le purine (adenina o guanina) vengono perse, l'evento viene definito depurazione. L'idrolisi può provocare una conversione della citosina in uracile, rilasciando ammoniaca nel processo. Questo evento è chiamato deaminazione. La deaminazione può avvenire anche in altre basi (citosina, adenina o guanina).

  • Modello di sostituzione della base

Ci sono schemi comuni di sostituzione delle basi che si osservano nei campioni di DNA antico. Le sostituzioni di base di C > T e G > A sono osservate in misura maggiore nei campioni di DNA antico rispetto ai campioni di DNA moderno. Tuttavia, queste sostituzioni non sono equamente distribuite lungo le molecole di DNA. Le sostituzioni C > T si trovano più comunemente all'estremità 5' della molecola di DNA, mentre le sostituzioni G > A si trovano più comunemente all'estremità 3' della molecola di DNA.

  • Danni ossidativi

I danni ossidativi sono causati dall'interazione diretta delle radiazioni ionizzanti con il DNA o dall'interazione dei radicali liberi (creati dalle molecole d'acqua dalle radiazioni ionizzanti) con il DNA, dando luogo a basi modificate. Alcuni danni ossidativi si traducono in lesioni che bloccano l'enzima polimerasi e promuovono sequenze chimeriche attraverso il "salto della PCR".

  • Cross-linking

Il cross-linking può avvenire tra basi sullo stesso filamento di DNA, chiamato anche cross-linking interstrand, o tra il DNA e altre molecole, chiamato anche cross-linking intermolecolare. Nei cross-link intermolecolari, il DNA può essere associato a un altro filamento di DNA o a una proteina. I legami incrociati possono impedire l'amplificazione delle molecole stampo endogene, ma nel tempo potrebbero anche stabilizzare la molecola di DNA, riducendo così la frammentazione.

  • Frammentazione

Come descritto in precedenza, il DNA antico accumula molti tipi di danni, comprese le rotture dei filamenti e la depurinazione, che porta alla frammentazione in brevi molecole di DNA. Poiché i filamenti di DNA sono già frammentati, non abbiamo bisogno di esporre il campione ad un'ulteriore frammentazione nella fase di preparazione del Next Generation Sequencing. Secondo studi recenti, la lunghezza media dei frammenti di DNA antico varia tra 50 e 150 bp.

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