Sintesi del cDNA
Il cDNA (DNA complementare) è complementare all'mRNA e viene sintetizzato dall'enzima trascrittasi inversa (RT) dallo stampo di mRNA. Poiché è basato sull'mRNA, il cDNA include solo le sezioni espresse di un gene, al contrario del DNA genomico che contiene invece l'intera sequenza genica.
Quando si studiano le regioni codificanti le proteine del genoma, lavorare con l'mRNA comporta alcuni problemi. In particolare, l'RNA è facilmente degradato a causa delle RNasi presenti ovunque. Pertanto, la trascrizione inversa da mRNA a cDNA crea un campione più stabile e affidabile per analizzare una particolare sezione del genoma, per esempio tramite PCR. È importante ricordare che le tecniche basate sulla PCR come il sequenziamento e la qPCR comportano l'uso di DNA polimerasi, che possono utilizzare il cDNA ma non l'mRNA come substrato.
Il primer utilizzato per la sintesi di cDNA a partire da mRNA è solitamente un primer oligo(dT), che è in grado di appaiarsi alla coda poli(A) delle molecole di mRNA. A volte si usano anche primer esameri casuali che, in base alla sequenza dell'esamero, si legano in modo casuale a qualsiasi RNA nel campione. Dopo la sintesi del cDNA si forma un ibrido DNA-RNA. Infine l'RNA viene digerito dalla RNasi H, che produce una molecola di cDNA a singolo filamento che può essere utilizzata direttamente in qualsiasi tecnica basata sulla PCR. Se è richiesto un cDNA a doppio filamento, il DNA a singolo filamento risultante può ripiegarsi su se stesso e l'estremità 3' si lega a una sequenza complementare sullo stesso filamento. Il DNA a doppio filamento risultante funge da primer per la DNA polimerasi che produce il filamento complementare.
Quando si effettua la trascrizione inversa dell'mRNA isolato da un campione di tessuto, tutte le molecole di mRNA vengono trascritte. Pertanto, copie molto abbondanti di mRNA (a causa di un'elevata espressione genica) daranno origine a copie molto abbondanti di cDNA. Allo stesso modo i geni che non sono espressi, e che quindi hanno poche o nessuna copia di mRNA trascritte, non saranno rappresentati nel campione di cDNA.