Generazione dei cluster
Dopo aver completato la preparazione del campione per il NGS, il DNA deve essere ancorato alla superficie di un chip dove verrà amplificato nuovamente e quindi sequenziato. Tale superficie è detta anche cella di flusso (vedi Figura 1 in basso). Ci sono molte molecole corte di DNA legate alla superficie della cella di flusso, che creano un'area a densità molto elevata.
Sono presenti due sequenze brevi di DNA legate alla superficie della cella di flusso (qui rappresentate in verde e giallo). Ognuna di queste molecole corte di DNA è complementare a un filamento dell'adattatore aggiunto in precedenza al campione di DNA, che consente quindi un legame specifico alla cella di flusso. Un adattatore si legherà alla molecola verde, mentre l'altro adattatore si legherà alla molecola gialla.
Figura 1
Passaggi per la generazione di cluster
Dopo che le molecole si sono legate alla cella di flusso, avvengono due ulteriori passaggi. Nota che la diversa colorazione nella Figura 1 e nella Figura 2 è irrilevante, dal momento che mostra solamente che ci sono due diverse molecole brevi di DNA legate alla cella di flusso.
1 - Amplificazione PCR a ponte
Il campione di DNA (in giallo) legato all'aggancio del filamento di DNA (in blu) si piegherà e si legherà alla molecola del filamento di DNA complementare (in viola), creando quindi un "ponte" (vedi Figura 2). Una polimerasi si legherà poi alla molecola in viola e la utilizzerà come stampo per creare una copia complementare.
Il ponte è quindi spezzato e ciascuna molecola di DNA adesso è legata solamente ad una molecola breve di DNA. Il processo viene ripetuto diverse volte, generando un cluster, e in questo cluster possiamo trovare campioni di DNA che sono legati alle sequenze di aggancio del DNA blu e viola. Dopo l'amplificazione PCR a ponte sono presenti circa 4.000 molecole di DNA in ciascun cluster, ma la metà viene eliminata tramite lavaggio; perciò restano solamente 2.000 molecole di DNA per cluster.
Figura 2: Generazione di cluster che mostra la PCR e l'amplificazione a ponte.
2 - Separazione
In questo momento abbiamo due filamenti di DNA complementari legati alla superficie della cella di flusso, ma in questo caso vogliamo sequenziare solo uno di essi (ad esempio solo il DNA che è legato alla sequenza di aggancio blu). Elimineremo le altre molecole di DNA che sono legate alla molecola viola; pertanto, continueremo con le molecole sintetizzate con lo stesso orientamento. In ogni cluster troviamo dei DNA che sono legati solamente alla molecola blu, i quali sono identici perché clonati tramite amplificazione. Alla fine della procedura di generazione di cluster, in una cella di flusso ci aspettiamo di trovare approssimativamente 200 milioni di cluster di DNA amplificati tramite clonazione. Alla fine di questo processo resta molto DNA da poter sequenziare mediante il processo NGS.