Generazione dei cluster

Dopo aver completato la preparazione del campione NGS, il DNA deve essere ancorato a una superficie della piastra dove verrà nuovamente amplificato e poi sequenziato. Questa superficie della piastra è anche chiamata cella di flusso e ha un'alta densità di brevi filamenti di DNA attaccati alla sua superficie. Le molecole di DNA sono in grado di legarsi a un adattatore sulla cella di flusso, poiché le sequenze sono complementari.

FASI DI GENERAZIONE DEI CLUSTER:

Dopo che le molecole di DNA sono legate alla cella di flusso, si verificano due fasi.

Ponte PCR

La molecola di DNA che è legata alla molecola di DNA corta (molecola blu) si piega e si lega all'altra molecola (molecola viola), creando un "ponte" (vedi Figura 1). Una polimerasi si attaccherà alla molecola viola e amplificherà il DNA, creando due molecole di DNA che sono complementari l'una all'altra. Il ponte viene poi rilasciato, e ciascuna delle molecole di DNA rimane legata a una sola molecola di DNA corta. Il processo viene ripetuto varie volte, generando un cluster, e in questo cluster possiamo trovare entrambi i DNA, le molecole di DNA che sono legate alla molecola blu e la molecola di DNA che è legata alla molecola viola. Circa 4.000 molecole di DNA si trovano in ogni cluster dopo l'amplificazione PCR a ponte, ma la metà di esse viene lavata via, lasciando solo 2.000 molecole di DNA per cluster. Questo passo è descritto di seguito.

Flush

Al momento abbiamo due filamenti di DNA complementari fissati alla superficie della cella di flusso. Ma vogliamo sequenziare solo cluster di DNA identico (clonale) (per esempio, solo il DNA che è legato alla molecola blu). Elimineremo le altre molecole di DNA che sono legate alla molecola viola; quindi, ora avremo solo molecole di DNA che sono state sintetizzate con lo stesso orientamento. Pertanto, in ogni cluster, avremo solo filamenti di DNA legati alla molecola blu. Essi sono identici perché sono stati amplificati clonalmente. Alla fine della fase di generazione dei cluster possiamo aspettarci di avere circa 200 milioni di cluster di DNA amplificati clonalmente in una cella di flusso. Questa è una grande quantità di DNA che è pronto per essere sequenziato.

Figura 1. La generazione dei cluster mostra il ponte PCR e l'amplificazione.