Inibizione competitiva
L'equazione a doppia reciprocità per l'inibizione competitiva è la seguente:
1/V0 = 1/Vmax + Km • α/Vmax • 1/[S] dove α = 1 + I/ KI
Sulla base di questa equazione, un grafico a doppia reciprocità dovrebbe dare una linea retta, con l'intercetta 1/ Vmax e la pendenza Km • α / Vmax. Differenti diagrammi Lineweaver-Burk con diverse concentrazioni di inibitore dovrebbero, quindi, dare pendenze diverse (perché α aumenta con la concentrazione dell'inibitore), ma la stessa intercetta y. Ciò significa che la Vmax a diverse concentrazioni di un inibitore competitivo è invariata; tuttavia, l'apparente Km, Km(app) (Km(app) = Km • α), è diversa. Se i tracciati a doppia reciprocità di 1/V0 rispetto a 1/[S] con varie concentrazioni di inibitore producono linee rette, con pendenze diverse, ma con la stessa intercetta y, l'inibitore è competitivo (Figura 1) [1].
Figura 1: Figura a: grafico Lineweaver-Burk che mostra l'inibizione competitiva. Figura b: Mostra le pendenze di ogni regressione lineare tracciata in rapporto alla concentrazione dell'inibitore.
Calcolo di KI, Km e Vmax
Se l'inibitore è competitivo, deve essere calcolata solo 1 costante d'inibizione. Per calcolare la costante di inibizione, devono essere condotti diversi saggi con diverse concentrazioni di inibitore. Ciascuna delle serie di dati risultanti dovrebbe essere tracciata; le pendenze e le intercette y possono essere determinate dalla regressione lineare. Da questi adattamenti, Vmax può essere calcolato come il reciproco dell'intercetta y. Se nessuno dei parametri cinetici è stato determinato, questo adattamento lineare non fornisce abbastanza informazioni per determinare KI e Km. Per determinare questi parametri, è necessario tracciare le ''pendenze'' dai diversi saggi in rapporto alla concentrazione dell'inibitore. Quindi, sulla base della seguente equazione:
Pendenza competitiva = Km • α/Vmax = Km/Vmax + Km/Vmax • 1/KI • [I]
Anche questo grafico dovrebbe quindi risultare in una linea retta con l'intercetta Km / Vmax, e pendenza (Km / Vmax ) • 1 / KI. Così, KI può essere calcolato dividendo l'intercetta y con la pendenza. Poiché Vmax è già stato calcolato, Km può essere calcolato dall'intercetta y di questo adattamento, moltiplicando questa intercetta per Vmax.
Fasi di calcolo dei parametri cinetici quando si usa un inibitore competitivo
Preparare i grafici Lineweaver-Burk dei dati cinetici e adattare i dati utilizzando la regressione lineare (1 adattamento per concentrazione di inibitore). Le intercette y dei grafici Lineweaver-Burk a diverse concentrazioni di inibitore dovrebbero essere le stesse (o almeno vicine). Prendere il reciproco dell'intercetta y; questo è Vmax. Tracciare le pendenze di ciascuna di queste linee in funzione della concentrazione dell'inibitore in un nuovo grafico, e adattare questo grafico usando la regressione lineare. Per calcolare Km, moltiplicare l'intercetta y di questa linea con Vmax. Per calcolare KI, dividere l'intercetta y di questa linea con la pendenza.
Fonti
- Lehninger, Albert L.; Nelson, David L.; Cox, Michael M. (2008). Principles of Biochemistry (5th ed.). New York, NY: W.H. Freeman and Company. ISBN 978-0-7167-7108-1.