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Inibizione competitiva

L'equazione a doppia reciprocità per l'inibizione competitiva è la seguente:

1/V0 = 1/Vmax + Km • α/Vmax • 1/[S] dove α = 1 + I/ KI

Sulla base di questa equazione, un grafico a doppia reciprocità dovrebbe dare una linea retta, con l'intercetta 1/ Vmax e la pendenza Km • α / Vmax. Differenti diagrammi Lineweaver-Burk con diverse concentrazioni di inibitore dovrebbero, quindi, dare pendenze diverse (perché α aumenta con la concentrazione dell'inibitore), ma la stessa intercetta y. Ciò significa che la Vmax a diverse concentrazioni di un inibitore competitivo è invariata; tuttavia, l'apparente Km, Km(app) (Km(app) = Km • α), è diversa. Se i tracciati a doppia reciprocità di 1/V0 rispetto a 1/[S] con varie concentrazioni di inibitore producono linee rette, con pendenze diverse, ma con la stessa intercetta y, l'inibitore è competitivo (Figura 1) [1].

A sinistra è un grafico Lineweaver-Burk con 1 diviso per V sull'asse y e 1 diviso per la concentrazione del substrato sull'asse x. Il grafico mostra l'inibizione competitiva come tre linee diverse nel colore verde, blu e rosso. Queste linee rappresentano trame diverse con diverse concentrazioni di inibitore e, pertanto, hanno pendenze diverse. Tuttavia, tutte e tre le linee si intersecano nello stesso punto dell'asse y. La linea verde ha una concentrazione di inibitore più alta e quindi aumenta più velocemente delle altre due linee. La linea blu ha una concentrazione di inibitore più bassa della linea verde; tuttavia, ha una concentrazione più alta della linea rossa, che è la linea con l'aumento più lento. A destra c'è un altro grafico che mostra le pendenze di ogni regressione lineare tracciata in rapporto alla concentrazione dell'inibitore. Il grafico mostra che all'aumentare della concentrazione dell'inibitore, aumenta anche la pendenza della linea di regressione lineare

Figura 1: Figura a: grafico Lineweaver-Burk che mostra l'inibizione competitiva. Figura b: Mostra le pendenze di ogni regressione lineare tracciata in rapporto alla concentrazione dell'inibitore.

Calcolo di KI, Km e Vmax

Se l'inibitore è competitivo, deve essere calcolata solo 1 costante d'inibizione. Per calcolare la costante di inibizione, devono essere condotti diversi saggi con diverse concentrazioni di inibitore. Ciascuna delle serie di dati risultanti dovrebbe essere tracciata; le pendenze e le intercette y possono essere determinate dalla regressione lineare. Da questi adattamenti, Vmax può essere calcolato come il reciproco dell'intercetta y. Se nessuno dei parametri cinetici è stato determinato, questo adattamento lineare non fornisce abbastanza informazioni per determinare KI e Km. Per determinare questi parametri, è necessario tracciare le ''pendenze'' dai diversi saggi in rapporto alla concentrazione dell'inibitore. Quindi, sulla base della seguente equazione:

Pendenza competitiva = Km • α/Vmax = Km/Vmax + Km/Vmax • 1/KI • [I]

Anche questo grafico dovrebbe quindi risultare in una linea retta con l'intercetta Km / Vmax, e pendenza (Km / Vmax ) • 1 / KI. Così, KI può essere calcolato dividendo l'intercetta y con la pendenza. Poiché Vmax è già stato calcolato, Km può essere calcolato dall'intercetta y di questo adattamento, moltiplicando questa intercetta per Vmax.

Fasi di calcolo dei parametri cinetici quando si usa un inibitore competitivo

Preparare i grafici Lineweaver-Burk dei dati cinetici e adattare i dati utilizzando la regressione lineare (1 adattamento per concentrazione di inibitore). Le intercette y dei grafici Lineweaver-Burk a diverse concentrazioni di inibitore dovrebbero essere le stesse (o almeno vicine). Prendere il reciproco dell'intercetta y; questo è Vmax. Tracciare le pendenze di ciascuna di queste linee in funzione della concentrazione dell'inibitore in un nuovo grafico, e adattare questo grafico usando la regressione lineare. Per calcolare Km, moltiplicare l'intercetta y di questa linea con Vmax. Per calcolare KI, dividere l'intercetta y di questa linea con la pendenza.

Fonti

  1. Lehninger, Albert L.; Nelson, David L.; Cox, Michael M. (2008). Principles of Biochemistry (5th ed.). New York, NY: W.H. Freeman and Company. ISBN 978-0-7167-7108-1.

Inibitori

Panoramica della teoria

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