Estrazione del DNA
L'estrazione del DNA dalle cellule può essere eseguita utilizzando il metodo fenolo-cloroformio. Questo metodo produce un DNA genomico costituito da milioni di geni. Per poter isolare un particolare gene di interesse dal DNA genomico può essere impiegata la PCR con dei primer specifici. Se il gene di interesse è stato fornito in un vettore, possono essere usati specifici enzimi di restrizione per ottenere l'isolamento.
Estrazione tramite fenolo-cloroformio
Gli acidi nucleici possono essere isolati dalle cellule tramite l'utilizzo del metodo fenolo-cloroformio. Il fenolo-cloroformio è una miscela di un buffer saturato di fenolo e cloroformio avente una proporzione di 1:1. Il primo passaggio dell'estrazione è la lisi della cellula e l'omogeneizzazione in una soluzione acquosa. Successivamente, alla miscela viene aggiunto il fenolo-cloroformio creando così due fasi che vengono ulteriormente separate dalla centrifugazione. Il fenolo purificato ha una densità di 1.07 g/cm3 mentre il cloroformio ha una densità maggiore (1.47 g/cm3). Di conseguenza, la centrifugazione genera due fasi: la fase organica inferiore e la fase acquosa superiore.
Gli acidi nucleici acquistano polarità dalla spina dorsale carica negativamente; pertanto, questi sono solubili nella fase superiore acquosa. Le proteine contengono regioni idrofobiche che interagiscono con il fenolo e causano la precipitazione delle proteine nel punto di interfaccia tra le due fasi (spesso come flocculazione bianca): I lipidi hanno anch'essi una regione idrofobica e si dissolvono nella fase organica inferiore.
Il ph della miscela determina la separazione degli acidi nucleici. Con pH neutro, RNA e DNA sono trattenuti nella fase acquosa superiore, ma con pH acido, il DNA si sposta nella fase organica inferiore mentre l'RNA resta nella fase acquosa superiore. Nell'ultimo passaggio, gli acidi nucleici vengono recuperati dalla fase acquosa attraverso la precipitazione indotta tramite alcol isopropilico.
NanoDrop
La resa dell'DNA (o concentrazione del DNA) e la purezza possono essere determinate misurando l'assorbanza tramite uno spettrofotometro. Il NanoDrop è uno spettrofotometro in grado di misurare l'assorbanza da 0,5-2 μl utilizzando un sistema di immagazzinamento del campione. Il sistema di immagazzinamento del campione consente la misurazione di campioni con un'alta concentrazione senza diluizione. L'assorbanza è misurata a 260nm (A260) punto in cui il DNA assorbe maggiormente la luce. La quantità di luce assorbita è proporzionale alla quantità di DNA presente nel campione.
La relazione è descritta dalla legge di Beer-Lamber come segue: c = (A \· ε)/b
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c : la concentrazione di acido nucleico
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A : l'assorbanza in AU
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ε : Il coefficiente di estinzione dipendente dalla lunghezza d'onda in ng-cm/μL
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b : la lunghezza del percorso in cm
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Il coefficiente di estinzione del DNA a doppia elica è 50ng-cm/μL
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In questo caso la lunghezza del percorso del NanoDrop è di 10 mm
La purezza del DNA può essere stimata misurandola a λ = 280 nm, λ = 230 nm, e λ = 320nm, calcolando la proporzione di 260/280nm, 260/230 nm, e 260/320 nm. Gli acidi nucleici assorbono fortemente la luce a 260 nm mentre i contaminanti organici quali il fenolo e il TRizol assorbono luce a 230 nm, le proteine invece assorbono luce a 280 nm.
Per 260/280, una proporzione approssimativamente di 1,8 è comunemente accettata come DNA puro, mentre per l'RNA puro, la proporzione è approssimativamente di 2. Per 260/320, una proporzione di 1,8-2,2 generalmente significa che il campione di acido nucleico è considerato puro. Per 260/230, una proporzione di <1,8 indica una presenza significativa di contaminanti organici.