Sequenziamento del DNA

Il sequenziamento è una tecnica utilizzata per "leggere" l'ordine preciso dei nucleotidi in un frammento di DNA. Brevi frammenti di DNA, geni e persino interi genomi possono essere sequenziati.

La tecnica di sequenziamento del DNA maggiormente utilizzata si basa sul metodo di terminazione di catena elaborato da Sanger. Questo metodo è molto simile a quello della reazione a catena della polimerasi (PCR) ma coinvolge solamente un primer, il quale si legherà alla regione di interesse all'estremità 3' del modello di DNA (Figura 1). Durante il sequenziamento, un miscela di nucleotidi normali (dATP, dTTP, dCTP, and, dGTP) e di nucleotidi detti "stop" (ddATP, ddTTP, ddCTP, and ddGTP) vengono aggiunti al modello di DNA. Ognuno dei nucleotidi stop viene marcato con un colore specifico. In ogni ciclo il DNA bersaglio viene replicato dalla DNA polimerasi finché non viene aggiunto un nucleotide stop, il quale arresta un'ulteriore elongazione (terminazione di catena). Dopo 35 cicli, vengono prodotti un elevato numero di frammenti di tutte le possibili dimensioni. Questi frammenti vengono fatti correre su un particolare gel di poliacrilammide-urea, dove i nucleotidi marcati vengono poi rilevati uno a uno e di conseguenza, può essere ricostruita l'esatta sequenza del DNA presente nel frammento.

Lo scopo del sequenziamento è quello di predire la sequenza proteica di un gene, per confrontare le sequenze delle specie (geni o genoma), oppure di identificare una mutazione.

Figura 1: Schema del metodo di sequenziamento di Sanger (terminazione di catena)

I frammenti di DNA di tutte le dimensioni possibili vengono prodotti durante i cicli di elongazione, ognuno dei quali termina con un nucleotide stop colorato. Quando i frammenti vengono separati sul gel in base alla loro dimensione, l'ordine dei colori identificato indicherà la sequenza precisa di DNA.