Parametri per l'elettroporazione

Tensione

La condizione elettrica per l'elettroporazione varia per ogni microrganismo. Per esempio, il lievito, come il Saccharomyces cerevisiae, ha una condizione elettrica ottimale con 40μL di cellule e 1,5 kV per circa 5ms.

Cellule

Per aumentare l'efficacia dell'elettroporazione si usano le cellule elettro-competenti. Le cellule di lievito sono rese elettrocompetenti mediante il lavaggio con una soluzione non ionica per rimuovere tutti i sali. Questo processo assicura che la carica non sia condotta attraverso il terreno di coltura. L'elettroporazione ottimale per il lievito si ottiene utilizzando lieviti in fase esponenziale media o tardiva. La fase esponenziale del lievito può essere divisa in tre parti:

• Fase esponenziale precoce: il periodo in cui la densità delle cellule è di circa 10⁷ cellule/mL.
• Fase esponenziale media: le colture hanno densità compresa tra 1 e 5 · 10⁷ cellule/mL.
• Fase esponenziale tardiva: si verifica quando la densità delle cellule è compresa tra 5 · 10⁷ e 2 · 10⁸ cellule/mL.

Nella fase esponenziale, il tasso di crescita è rapido e il tasso di divisione cellulare supera il quello della morte cellulare. Le cellule sono metabolicamente attive e hanno una replicazione del genoma sufficiente per condurre un'efficiente riparazione del DNA. Pertanto, le cellule in questa fase possono tollerare un trattamento aggressivo come l'elettroporazione.

DNA

La frequenza di trasformazione viene aumentata aumentando la concentrazione di DNA nel buffer di elettroporazione. Tuttavia, una concentrazione di DNA troppo elevata rischia di compromettere l'efficacia di trasformazione. La concentrazione esatta di DNA deve essere determinata per ogni esperimento.

Terreni di elettroporazione

Per evitare la ionizzazione del campione durante l'elettroporazione, è importante lavare accuratamente la cellula elettrocompetente per rimuovere il terreno di coltura. Il lavaggio può essere eseguito con acqua o con una soluzione non ionica come glucosio, glicerolo, saccarosio, sorbitolo o polietilenglicole. La presenza di materiale ionico può infatti causare un arco elettrico durante l'elettroporazione.

Il sorbitolo è la soluzione di lavaggio più usata perché agisce come un crioprotettore non permeante che riduce significativamente i danni alla membrana cellulare durante lo scongelamento. I danni alla membrana compromettono significativamente l'efficacia della trasformazione.

Durante la procedura di elettroporazione, la temperatura aumenta e le cellule subiscono danni alla membrana causati dal rapido afflusso ed efflusso di acqua dovuto allo squilibrio osmotico tra l'ambiente extracellulare e intracellulare. Questo tipo di danno può essere prevenuto utilizzando uno stabilizzatore osmotico come il sorbitolo, che agisce come crioprotettore e osmoregolatore.