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Saggio di cinetica enzimatica

La cinetica enzimatica è lo studio dei meccanismi enzimatici attraverso la determinazione delle velocità di reazione in condizioni diverse. La velocità di una reazione dipende da diversi fattori, tra cui la concentrazione del substrato e dell'enzima, la temperatura, il pH e la presenza di inibitori. [1]

In alto un'illustrazione della curva di saturazione di Michaelis-Menten. Sull'asse x c'è la concentrazione del substrato e sull'asse y la velocità di reazione. Una curva di Michaelis-Menten è adattata al grafico come una curva che aumenta velocemente e poi si stabilizza poco dopo. I dati sono segnati con punti e una linea tra loro è disegnata in blu. Il grafico mostra che all'aumentare della concentrazione del substrato, aumenta anche la velocità di reazione. L'aumento della velocità di reazione è rapido all'inizio della reazione, ma quando la concentrazione del substrato aumenta ulteriormente, la velocità di reazione rallenta e la curva inizia a stabilizzarsi. A questo punto, la reazione si avvicina alla sua velocità massima, che è segnata sul grafico come V max. ½ • V max è anche segnato sul grafico, dove la reazione ha raggiunto il 50% della sua velocità massima. Una terza variabile sul grafico è il k m che è uguale alla concentrazione del substrato dove la velocità di reazione è ½ • V max. In basso c'è un'altra illustrazione di un grafico che ha il tempo sull'asse x e la formazione del prodotto sull'asse y. La curva riflette la reazione enzimatica generale, che è mostrata come il cambiamento di concentrazione nel tempo. Il cambiamento è il risultato della formazione del prodotto creato dal substrato. All'aumentare del tempo, aumenta anche il prodotto in modo lineare fino a quando la curva inizia a stabilizzarsi come risultato di una velocità di reazione decrescente

Figura 1: In alto: curva di saturazione di Michaelis-Menten. In basso: Curva di progresso di una reazione enzimatica generale.

Esecuzione di saggi cinetici

Lo scopo di un saggio cinetico è quello di simulare la velocità di reazione, V, in funzione della concentrazione del substrato, [S], come illustrato nella Figura 1. È quindi necessario misurare la velocità a diverse concentrazioni di substrato. Per ogni concentrazione di substrato, si ottiene una curva di progresso che mostra la quantità di prodotto formato in funzione del tempo. Tale curva di progresso è illustrata nella Figura 1. Come mostra la figura, la velocità della reazione è approssimativamente costante all'inizio della reazione; tuttavia, quando il substrato è esaurito, la velocità diminuisce, e la curva di progresso raggiunge un plateau. Poiché [S] cambia durante la reazione, è comune misurare le velocità iniziali (V0) delle reazioni e tracciarle in rapporto alla concentrazione del substrato. V0 è misurato come la pendenza della curva di progresso all'inizio della reazione quando la curva di progresso è ancora lineare [1].

Il modello più semplice di V in funzione di [S] è l'equazione di Michaelis-Menten. Le reazioni in cui l'equazione di Michaelis-Menten può essere applicata mostrano un aumento della velocità di reazione quando [S] è aumentato; tuttavia, questo aumento diminuisce quando ci si avvicina alla velocità massima, Vmax come si vede nella figura 1. L'equazione di Michaelis-Menten sarà ulteriormente descritta nelle pagine seguenti [1].

Fattori che influenzano la velocità di reazione

Anche la temperatura e il pH influenzano la velocità di reazione. Gli enzimi hanno un pH ottimale, che dipende dalla composizione dell'enzima. Ciò è dovuto alle proprietà delle catene laterali degli aminoacidi dell'enzima: alcune catene laterali devono essere protonate o deprotonate per creare un enzima funzionale. Se la catena laterale di un aminoacido è protonata o deprotonata dipende dal pKa della catena laterale e dal pH della soluzione. Per esempio, l'istidina ha un pKa di 6.0, il che significa che sarà principalmente protonata a pH<6.0 e principalmente deprotonata a pH>6.0. Si noti che il pKa delle catene laterali può essere alterato dall'ambiente; quindi il pKa delle catene laterali negli enzimi non è solitamente lo stesso degli aminoacidi liberi. Anche la temperatura influenza la velocità di reazione: un aumento della temperatura porta ad un aumento della velocità di reazione; tuttavia, ad una certa temperatura, a seconda dell'enzima, l'enzima inizierà a denaturare; quindi, la velocità di reazione inizierà a diminuire oltre questa temperatura [1].

Il simulatore

In questo caso, userai un simulatore per eseguire gli esperimenti cinetici. Questo simulatore è basato su un modello matematico, ed è quindi "perfetto", cioè non comporta alcun errore sperimentale. Questo, ovviamente, non è il modo in cui il risultato di un saggio cinetico enzimatico funzionerebbe nella vita reale, dove dati così perfetti non sarebbero ottenibili.

Fonti

  1. Lehninger, Albert L.; Nelson, David L.; Cox, Michael M. (2008). Principles of Biochemistry (5th ed.). New York, NY: W.H. Freeman and Company. ISBN 978-0-7167-7108-1.

Panoramica della teoria