Il microscopio a fluorescenza

Il microscopio a fluorescenza è simile al microscopio ottico. Invece di illuminare il campione con l'intero spettro della luce visibile, però, il microscopio a fluorescenza usa solo una specifica lunghezza d'onda. Per far ciò, utilizza un filtro di eccitazione che permette solo alla luce di una specifica lunghezza d'onda di raggiungere il campione, oppure dei laser che emettono solamente una specifica lunghezza d'onda. Questa corrisponde allo spettro di assorbimento del fluoroforo, che a sua volta emette una lunghezza d'onda più lunga che viene usata per produrre un'immagine. È preferibile usare il microscopio a fluorescenza in condizioni di scarsa illuminazione, così da poter individuare più chiaramente i segnali fluorescenti e da evitare il fotobleaching, ovvero la diminuzione della fluorescenza di un campione causata dal fatto che i coloranti fluorescenti sono sensibili alla luce.

Figura 1: una panoramica schematica dei componenti principali di un microscopio a fluorescenza: sorgente di luce, filtro di eccitazione, specchio dicroico e filtro di emissione.

I microscopi a fluorescenza sono dotati di un carosello con cubi portafiltri. I cubi consistono in un filtro di eccitazione, uno specchio dicroico e un filtro di emissione. La combinazione di questi filtri corrisponde alle lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione di determinati fluorofori. I cubi portafiltri sono quindi specifici per una determinata colorazione.

Dalla fonte di luce, la luce raggiunge un filtro di eccitazione che lascia passare solo la luce della lunghezza d'onda specifica che eccita il fluoroforo. Queste onde luminose colpiscono uno specchio dicroico che riflette la luce della lunghezza d'onda di eccitazione verso il campione, dove eccita il fluoroforo. La luce emessa si sposta su una lunghezza d'onda più lunga e viene raccolta dall'obiettivo. Quando la luce raggiunge lo specchio dicroico, questa luce di lunghezza d'onda più lunga passa attraverso gli oculari e/o la telecamera. La luce diffusa di altre lunghezze d'onda, invece, viene riflessa dallo specchio dicroico e non può essere rilevata attraverso gli oculari e/o la fotocamera. Il filtro di emissione tra lo specchio dicroico e la fotocamera filtra tutte le altre lunghezze d'onda (di sfondo).