Frammentazione

Una delle limitazioni del Next Generation Sequencing è la lunghezza del campione di DNA. L'attuale tecnologia Illumina può sequenziare fino a 250 bp. Il nostro genoma è molto più lungo; ad esempio, il cromosoma più lungo, che è il cromosoma 1, è lungo quasi 250 milioni di bp. Pertanto, nella preparazione del campione di NGS, il DNA deve essere frammentato o tagliato in una dimensione più piccola. Questo passo è tipicamente denominato passo di frammentazione.

Campioni di DNA più corti, per esempio campioni di DNA antico non hanno bisogno di essere frammentati perché sono già parzialmente degradati a circa 50 bp. Un altro esempio è il cDNA generato da miRNA (micro RNA), che è anch'esso molto corto.

Ci sono due modi per frammentare il DNA

Sonicazione:

nella sonicazione, il DNA viene frammentato esponendolo a onde sonore (di solito ultrasuoni). Quando una potente onda sonora colpisce il filamento di DNA crea rotture del doppio filamento, tagliando il lungo filamento di DNA in filamenti di DNA più piccoli. Per ottenere una dimensione specifica del DNA, la potenza e il tempo devono essere regolati.

Per via enzimatica:

i lunghi filamenti di DNA possono anche essere frammentati usando reazioni enzimatiche. Esistono diversi enzimi che sono in grado di tagliare i filamenti di DNA; possono mirare a sequenze specifiche o tagliare il DNA in modo casuale.