Clonazione Gateway

La tecnologia Gateway fornisce un percorso veloce ed efficiente per la clonazione. Questa tecnologia si basa sull'uso di versioni modificate delle ricombinasi del batteriofago lambda. Questo virus inserisce il suo genoma nel DNA dell'ospite usando questi enzimi. Il sistema di clonazione Gateway li utilizza per ottenere una ricombinazione ad alta efficienza e specifica del sito. La seconda caratteristica utile di questo sistema sono i suoi siti di riconoscimento per gli enzimi clonasi chiamati siti att, e l'uso di diversi tipi di vettori.

Guarda l'animazione qui sotto per avere una panoramica della reazione Gateway.

Reazioni BP e LR

Le reazioni BP e LR sono il modo in cui diversi segmenti di DNA vengono spostati da un posizione all'altro all'interno dei costrutti. Durante la reazione BP, i siti attB e attP sono ricombinati. Questa reazione scambia il DNA tra i filamenti, creando un sito attL e uno attR. Durante la reazione LR, i siti attL e attR sono ricombinati in modo simile, creando siti attB e attP. Esiste un numero limitato di siti att, che sono annotati con numeri, il che significa che c'è un numero limitato di combinazioni. Ogni sito si ricombina solo all'interno del gruppo: per esempio, i siti attL1 si ricombinano solo con i siti attR1, dando luogo ai siti attB1 e attP1. L'orientamento di questi siti è anche specifico, e il costrutto genico è altamente prevedibile. Il costrutto desiderato può essere costruito selezionando le estremità att appropriate, le reazioni e i vettori.

Tipi di vettori

I siti att riciclabili sono ideali per creare librerie di vettori che possono essere utilizzati per combinare in modo efficiente diverse parti di circuito.

• Vettore di espressione (AmpR): Il clone di espressione è il prodotto finale di una reazione Gateway. È il plasmide completo, pronto per la trasformazione.

• Vettore donatore (ccdB, KanR): Il vettore donatore fornisce la spina dorsale per la creazione di cloni di ingresso. I vettori donatori sono tipicamente indicati con nomi che iniziano con pDONR. Questi plasmidi portano siti attB o attP che fiancheggiano il gene ccdB, così come il gene della resistenza alla kanamicina.

• Vettore d'ingresso (KanR): I vettori di ingresso sono creati dal vettore donatore e da una sequenza di DNA fiancheggiata dai siti att corrispondenti. Queste sequenze di interesse sono solitamente prodotte tramite PCR, con primer che contengono i siti att. I vettori di ingresso contengono siti attL o attR che fiancheggiano la sequenza di interesse, così come il gene di resistenza alla kanamicina. I vettori di ingresso sono ideali per una libreria di parti di circuito.

• Vettore di destinazione (ccdB, AmpR): Il vettore di destinazione fornisce la spina dorsale per i cloni di espressione. I vettori di destinazione sono tipicamente indicati con nomi che iniziano con pDEST. Questi plasmidi contengono il gene ccdB affiancato da siti attL o attR, così come un gene di resistenza all'ampicillina. I vettori di destinazione contengono anche le origini di replicazione per ospiti specifici e ulteriori motivi di DNA.

Selezione

La selezione dei vettori di interesse nelle diverse fasi della procedura di clonazione Gateway è molto importante. Per la selezione, il sistema Gateway si basa su due resistenze agli antibiotici e il gene ccdB per la selezione positiva. La resistenza agli antibiotici permette alle cellule trasformate di crescere su un terreno contenente antibiotici che uccidono le cellule non trasformate.

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Il gene ccdB codifica una batteriotossina che impedisce la replicazione del DNA. Tutti le spine dorsali per i cloni Gateway (pDEST e pDONR) portano questo gene, e solo i batteri che portano un gene aggiuntivo ccdA cresceranno quando trasformati con questi plasmidi.