Elettroforesi su gel

L'elettroforesi su gel è un metodo impiegato per separare macromolecole cariche di diverse dimensioni e stimarne la lunghezza.

L'elettroforesi su gel è spesso utilizzata per separare frammenti di DNA amplificato con PCR:

Il campione viene caricato in piccoli pozzetti su un' estremità del gel di agarosio. Si applica la corrente elettrica al gel, posizionando l'elettrodo positivo all'estremità opposta ai pozzetti. Il DNA con carica negativa si muoverà nel gel verso l'elettrodo a carica positiva. Le molecole di DNA più piccole si muovono più velocemente nel gel rispetto a quelle più grandi, con conseguente separazione delle dimensioni. Dopo l'elettroforesi, si visualizza il DNA che si presenta sotto forma di strisce derivate da frammenti di DNA della stessa lunghezza. Con questo metodo è possibile visualizzare solo una grande quantità di DNA (milioni di copie). Sul gel viene caricato anche un "DNA ladder" contenente una miscela di frammenti di DNA di dimensioni note. Le dimensioni dei campioni di DNA possono essere stimate confrontando la distanza con il DNA ladder (Figura 1).

Figura 1. Frammenti di diverse lunghezze derivanti da una reazione di PCR vengono fatti scorrere su un gel. I frammenti si muoveranno a una velocità e a una distanza dipendente dalla loro dimensione: le molecole di DNA più piccole si muoveranno nel gel più velocemente rispetto a quelle più lunghe.

Mescolando il prodotto della PCR con il tampone di caricamento, possiamo visualizzare quanto il prodotto della PCR ha viaggiato nel corso dell'elettroforesi su gel. Il tampone di caricamento è utile anche per rendere il campione più pesante, affinché affondi sul fondo del gel.

Esistono numerose composizioni per il tampone di caricamento, ma in genere contiene le seguenti sostanze chimiche:

• Reagente colorante, come ad esempio xilene cianolo, rosso cresolo, blu di bromofenolo o arancione G.

Questo aggiungerà colore al campione e aiuterà a visualizzare la posizione del campione sul gel di agarosio.

• Reagente ad alta viscosità, come ad esempio Ficoll, saccarosio o glicerolo.

Questo renderà il campione più pesante aumentando la viscosità.

• Acqua per diluire i reagenti di cui sopra.