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Elettroforesi su gel

L'elettroforesi su gel è una tecnica utilizzata in laboratorio per separare i frammenti di DNA in base alla loro dimensione. Le suddette dimensioni possono essere stimate utilizzando una "scala di DNA" di riferimento.

Il DNA prodotto dalla PCR, viene caricato in dei piccoli pozzetti all'estremità di una banda di gel. Al gel viene poi applicato un campo elettrico (l'elettrode positivo si trova in posizione opposta ai pozzetti). Dal momento che il DNA è carico negativamente, si muoverà lungo il gel verso l'elettrode positivo. Le molecole di DNA più piccole si muovono più velocemente lungo il gel rispetto a quelle più grandi, grazie a ciò si ottiene la separazione in base alla dimensione. Dopo l'elettroforesi, il DNA apparirà sotto forma di bande sotto ad ogni pozzetto, ma solo una grande quantità di DNA (milioni di copie) può essere visualizzato. Sul gel viene caricata anche una scala di DNA contenente una miscela di frammenti di DNA di dimensione conosciuta. La dimensione dei campioni di DNA può essere quindi stimata attraverso il confronto con la scala di DNA (Figura 1).

Figura 1. Frammenti di lunghezza diversa derivati da una reazione PCR vengono fatti correre su un gel. I frammenti si sposteranno a una velocità e a una distanza relative alla loro dimensione: le molecole di DNA più piccole si sposteranno lungo il gel più velocemente, percorrendo una distanza maggiore rispetto alle molecole di DNA più lunghe. Fasi dell'elettroforesi su gel. Due immagini  presentano l'apparato di elettroforesi su gel, come rettangolo blu allineato verticalmente con bande in alto e gel di agarosio in basso, con un tempo pari a 0 min e un tempo pari a 45 min. Sopra l'apparato, dove vengono caricati i campioni, viene posizionato il catodo e sotto l'apparato viene posizionato l'anodo ed entrambi sono collegati all'alimentazione. Nella prima fase, i campioni di DNA vengono caricati nella parte superiore dell'apparato rettangolare. Nella seconda fase viene applicato un campo elettrico. Nella terza fase avviene la separazione del DNA, che può essere vista nella seconda immagine, dove sono visibili piccole bande orizzontali corte a diverse altezze all'interno del rettangolo blu. Il quarto passo è la transilluminazione UV e la documentazione.

Mescolando il prodotto della PCR con tamponi di carico, possiamo visualizzare la distanza percorsa dal prodotto della PCR durante l'elettroforesi su gel. I tamponi di carico sono anche utili per rendere il campione più pesante quando lo pipetti sul gel, in questo modo il campione precipita sul fondo del gel.

In un tampone di carico ci sono diverse componenti; tuttavia di solito contiene i seguenti elementi:

  • Reagenti coloranti, ad esempio, xilene cianolo, cresolo rosso, blu di boromofenolo o arancione G. In questo modo viene aggiunto il colore al campione e ti aiuterà a visualizzare la posizione del campione sul gel di agarosio.

  • Reagenti ad alta viscosità, ad esempio, ficoll, sucrosio o glicerolo. L'aggiunta di queste sostanze renderà il campione più pesante incrementando la viscosità generale del campione.

  • Acqua Per diluire i reagenti sopra menzionati.

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Riepilogo teoria