Elettroforesi su gel
L'elettroforesi su gel è un metodo utilizzato nei laboratori per separare frammenti di DNA di diverse dimensioni e per stimare tali dimensioni. Il DNA, ad esempio, un prodotto della PCR, viene caricato in piccoli pozzetti all'estremità di un gel. Viene quindi applicata una corrente elettrica al gel (l'elettrodo positivo opposto ai pozzetti). Poiché il DNA è caricato negativamente, si sposterà attraverso il gel verso l'elettrodo positivo. Le molecole di DNA più piccole si muoveranno più velocemente attraverso il gel rispetto alle molecole di DNA più grandi, portando alla separazione delle dimensioni. Dopo l'elettroforesi, il DNA viene visualizzato e appare sotto forma di bande sotto ciascun pozzetto. È possibile visualizzare solo una grande quantità di DNA (milioni di copie). Anche una "scala del DNA" contenente una miscela di frammenti di DNA di dimensioni note viene caricato sul gel. Le dimensioni dei campioni di DNA possono quindi essere stimate confrontandole con la scala del DNA (Figura 1).
Figura 1. Frammenti di lunghezza diversa derivanti da una reazione PCR vengono eseguiti su un gel. I frammenti si sposteranno a una velocità e a una distanza relative alla loro dimensione: le molecole di DNA più piccole si sposteranno lungo il gel più velocemente e più lontano delle molecole di DNA più lunghe.
Mescolando il prodotto della PCR con il buffer di caricamento, è possibile visualizzare quanto lontano ha viaggiato il prodotto PCR durante l'elettroforesi su gel. Il buffer di caricamento è anche utile per rendere il campione più pesante in modo che quando lo si pipetta sul gel, il campione sprofonderà sul fondo.
Esistono molte composizioni per il caricamento del buffer; tuttavia, in genere conterrà quanto segue:
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Reagente colorante, ad esempio xilene cianolo, rosso cresolo, blu bromofenolo o arancione G. Questo aggiungerà colore al campione e aiuterà a visualizzare la sua posizione sul gel di agarosio.
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Reagente ad alta viscosità, ad esempio Ficoll, saccarosio o glicerolo. Ciò renderà il campione più pesante aumentando la viscosità complessiva del campione.
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Acqua per diluire i suddetti reagenti.