Assemblaggio Gibson

L'assemblaggio Gibson è una tecnica di clonazione che, a differenza delle tecniche di clonazione tradizionali, non si basa su siti di restrizione ma sulla presenza di regioni omologhe sulle estremità dei pezzi di DNA.

I tre enzimi T5 esonucleasi, la Phusion DNA polimerasi e la Taq DNA ligasi elaborano ciascuno parti diverse delle estremità del DNA. In primo luogo, l'esonucleasi T5 rosicchia le estremità 5', creando delle sporgenze a singolo filamento complementari tra i due inserti. Questi overhang si appaiano e la polimerasi Phusion inserisce i nucleotidi mancanti tra la sequenza di DNA a doppio filamento, usando l'overhang omologo come sequenza di priming. Una volta avviata, la reazione di Phusion è molto più veloce della lenta nucleasi e le lacune vengono rapidamente riempite. Come ultimo passo, la ligasi chiude la rottura del filamento e fonde insieme i due frammenti di DNA. Tutti questi enzimi sono attivi a 50 ºC. Come risultato, più pezzi di DNA possono essere assemblati in una singola provetta.

L'assemblaggio Gibson è usato per costruire grandi circuiti da vettori di posizione.

Scopri di più su come preparare una reazione Gibson.