Preparazione dell'assemblaggio Gibson

Per l'assemblaggio Gibson hai bisogno di frammenti di DNA con estremità sovrapposte. Questi frammenti sono spesso ottenuti grazie a una digestione da restrizione con i corrispondenti enzimi di restrizione.

Per ottenere rese elevate del prodotto Gibson, lo stesso numero di ciascun frammento di DNA deve essere aggiunto alla miscela di reazione. Nella maggior parte dei casi i frammenti avranno lunghezze diverse, pertanto dovrai calcolare la concentrazione equimolare usando la seguente formula:

La concentrazione di diversi frammenti di DNA può essere misurata tramite l'utilizzo di un Nanodrop, ovvero uno strumento che consente la misurazione delle concentrazioni di acido nucleico in una porzione minima di liquido. La lunghezza dei frammenti può essere determinata dalle mappe del plasmide. Una volta calcolata la quantità necessaria per ciascun frammento, devi aggiungere acqua fino al volume predefinito della reazione. Per iniziare la reazione devi solamente aggiungere lo stesso volume di 2X della miscela di reazione Gibson e incubare il campione a 50 gradi Celsius per un'ora.