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Risoluzione dei problemi relativi alla colorazione di Gram

La colorazione di Gram è un procedimento delicato che richiede attenzione ai dettagli. Infatti, una scorretta applicazione delle tecniche di colorazione e preparazione dello striscio possono facilmente portare a risultati errati.

Preparazione dello striscio

  • Striscio batterico: qualora venisse applicato uno strato troppo spesso, i batteri Gram-negativi apparirebbero più scuri e potrebbero essere scambiati per Gram-positivi. Cerca di applicare sempre un solo strato dell'organismo che desideri studiare.

  • Fissazione: se durante la fissazione i batteri si surriscaldano, la parete cellulare si distrugge e i batteri non sono più in grado di trattenere il cristalvioletto; come conseguenza, tutti i batteri appariranno Gram-negativi.

  • Strisci di coltura scaduti: se gli strisci di coltura sono troppo vecchi, la parete cellulare batterica potrebbe essersi già rotta e i batteri non riuscirebbero più a trattenere la colorazione di cristalvioletto. Tutti i batteri, a quel punto, apparirebbero Gram-negativi.

Colorazione

La decolorazione porta spesso a risultati falsati durante una colorazione di Gram.

  • Decolorazione insufficiente: se l'alcol (decolorante) viene lavato via prima che abbia sortito il suo effetto sulla parete cellulare, le molecole di cristalvioletto non sfuggiranno alla parete cellulare Gram-negativa. Di conseguenza, dopo la colorazione di contrasto con safranina, tutti i batteri appariranno Gram-positivi (viola).

  • Decolorazione eccessiva: lasciare l'alcol (decolorante) sul vetrino per troppo tempo danneggia la parete cellulare dei batteri sia Gram-positivi che Gram-negativi. Poiché i batteri Gram-positivi non riescono a trattenere il cristalvioletto, dopo la colorazione di contrasto con safranina tutti i batteri appaiono Gram-negativi (rosa).
    La prima immagine presenta l'esito della decolorazione parziale. Due strutture a forma di fagiolo, rappresentanti delle cellule batteriche, sono colorate in viola. Una freccia blu esce da ciascuna di esse verso due sezioni trasversali della parete cellulare, una per i batteri Gram-positivi e una per i batteri Gram-negativi. In entrambe le strutture, anche se differiscono tra loro, sono presenti molecole viola di cristalvioletto, insieme a sfere arancioni che rappresentano lo iodio. La seconda immagine raffigura il risultato di una decolorazione eccessiva. Due strutture a forma di fagiolo, rappresentanti delle cellule batteriche, sono decolorate. Una freccia blu esce da ciascuna di esse verso due sezioni trasversali della membrana cellulare interna, una per i batteri Gram-positivi e una per i batteri Gram-negativi. In entrambe le strutture, le molecole viola di cristalvioletto e le molecole arancioni di iodio galleggiano sopra la membrana, senza essere intrappolate all'interno.

Figura 1. Decolorazione insufficiente. Decolorazione eccessiva.