Ligazione
Per ligazione si intende il processo svolto da un enzima noto come DNA ligasi che unisce in modo covalente il fosfato della spina dorsale del DNA a doppio filamento. La DNA ligasi, comunemente utilizzata nei laboratori di biotecnologia, è stata isolata dal batteriofago T4 o dall' E.coli. Entrambi catalizzano le reazioni di ligazione in modo simile, ma differiscono in quanto a requisiti di cofattore. L'enzima dell'E.coli richiede NAD+ mentre l'enzima T4 richiede l'ATP. Questi cofattori vengono forniti tramite un buffer.
Reazione di ligazione
La reazione di ligazione generalmente consiste in due passaggi:
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Collisione delle estremità del DNA. Questa collisione avviene casualmente e la frequenza con la quale si verifica è minore a basse temperature. Le basse temperature stabilizzano il legame di idrogeno tra i nucleotidi complementari. L'attività della DNA ligasi risulta ottimale a 25o. La regola generale è: tanto minore sarà la temperatura di incubazione, quanto minore dovrà essere la durata dell'incubazione.
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Reazione enzimatica. La DNA ligasi catalizza le giunzioni tra il 3'-idrossile verso il 5'-fosfato.
Reazione di ligazione. Il nucleotide AMP viene trasferito al 5'-fosfato. In seguito il legame fosfato AMP viene attaccato dal 3'-OH formando un legame covalente mentre rilascia AMP.
L'efficacia della reazione di ligazione può essere incrementata ottimizzando l'inserto: ovvero la proporzione del vettore. Una proporzione di 3:1 è un buon parametro iniziale. La concentrazione del DNA vettore e dell'inserto possono essere misurate utilizzando uno spettrofotometro come un Nanodrop. La formula necessaria per calcolare la quantità del gene di interesse (inserto) da aggiungere nella reazione di ligazione è:
Esempio di calcolo dell'ottimizzazione della reazione di ligazione :
Dati
I risultati della misurazione dello spettrofotometro sono:
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Concentrazione dell'DNA vettore: 30 ng/μL
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Concentrazione dell'inserto: 15 ng/μL
Abbiamo anche i dati relativi alla lunghezza del vettore e dell'inserto rispettivamente di 4000 bp e 1000 bp. La proporzione ottimale è di 3:1. Utilizzeremo 60 ng di DNA vettore.
Calcolo
(ng vettore · kb dimensione dell'inserto)/ kb dimensione del vettore · inserto/vettore = ng dell'inserto
- (60ng · 1 kb) / 4 kb · 3/1 = 45 ng dell'inserto
| Componente di reazione | Concentrazione della reazione | Volume | ||
|---|---|---|---|---|
| 10x Buffer ligazione, T4 DNA Ligasi | 1X | 20 μL/ 10x = 2μL | ||
| DNA vettore | 60ng | 60ng/30ng/μL= 2μL Inserto | ||
| T4 DNA Ligasi | 1 unità | 1 μL | ||
| Totale | 20 μL |
Vettore plasmidico
Il vettore di espressione contiene numerosi siti di clonaggio, un marcatore selezionabile, un'origine di replicazione, un operatore e un promotore forte. 
I plasmidi sono molecole extra-cromosomiche di DNA, in gran parte a doppio filamento, con chiusure covalenti e molecole circolari. La loro dimensione varia da 1kb fino a 200 kb. Non tutti i plasmidi sono vettori. Una molecola di DNA come un plasmide necessita di alcune caratteristiche per poter fungere da vettore per la clonazione genica. Generalmente esistono due tipi di vettori a seconda delle loro applicazioni: vettori di clonazione e vettori di espressione.
Entrambi questi tipi sono dotati della caratteristica che un vettore dovrebbe possedere, vale a dire un marcatore genetico selezionabile, un'origine della replicazione e siti di clonaggio multiplo. Tuttavia, i vettori di espressione possiedono un'ulteriore caratteristica, ossia un promotore forte utilizzato per l'espressione della proteina estranea codificata nel gene di interesse. I vettori di espressione potrebbero contenere un operatore così come un gene regolatore. L'operatore è un segmento di DNA al quale si lega un fattore di trascrizione. I vettori di clonaggio sono principalmente utilizzati per trasportare e moltiplicare il gene di interesse.
Un marcatore selezionabile viene utilizzato per assicurarsi che il vettore ospite mantenga il plasmide specifico. Un'origine della replicazione consente al plasmide di moltiplicarsi all'interno della cellula indipendentemente dal cromosoma ospite principale.
Assemblaggio del plasmide
In linea di principio, l'assemblaggio del plasmide prevede i seguenti passaggi:
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Il plasmide vettoriale circolare chiuso e il frammento del gene di interesse vengono scissi da uno o più enzimi di restrizione.
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Il gene di interesse è ligato al vettore plasmidico linearizzato.
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Il plasmide risultante viene trasformato in un ospite adeguato.
Diversi enzimi di restrizione possono generare sporgenze compatibili. 
Il tasso di successo più elevato nell'assemblaggio del plasmide si ottiene utilizzando frammenti di DNA con 5' o 3' coesive/sporgenti rispetto all'assemblaggio del plasmide con frammenti di DNA con estremità piatte. La DNA ligasi congiunge due frammenti di DNA con sporgenze compatibili. Un frammento di DNA con una particolare sporgenza può essere ligato non solo al frammento tagliato dallo stesso enzima di restrizione, ma anche a qualsiasi altro frammento con estremità compatibili generato da altri enzimi di restrizione.
L'avvenuto assemblaggio del plasmide può essere determinato eseguendo il sequenziamento del DNA. É importante convalidare che l'inserto sia stato ligato nel vettore plasmidico con successo, e che abbia la corretta conformazione e il corretto frame di lettura. Il frame shift può causare mutazioni nonsenso o missenso che portano all'espressione di proteine disfunzionali.