Spettrometria di massa
Principio
Lo spettrometro di massa è uno strumento analitico utilizzato per misurare la massa molecolare di un campione. Le tre parti fondamentali di uno spettrometro di massa sono la sorgente di ionizzazione, l'analizzatore e il rivelatore. Lo spettrometro di massa fa quanto segue:
- produce ioni dal campione nella sorgente di ionizzazione.
- separa tali ioni in base al rispettivo rapporto massa/carica nell'analizzatore di massa.
- frammenta gli ioni selezionati e analizza i frammenti in un secondo analizzatore.
- rileva gli ioni che emergono dall'ultimo analizzatore e ne misura l'abbondanza con il rivelatore che converte gli ioni in segnali elettrici.
- elabora i segnali del rivelatore che vengono trasmessi al computer e controlla lo strumento mediante feedback.
MALDI
Ci sono una varietà di metodi di ionizzazione disponibili, ma quelli più comunemente usati sono: ionizzazione elettrospray (ESI) e desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI). In questo laboratorio usiamo il MALDI.
Ci sono due fasi principali nel MALDI, che utilizza un laser UV per ionizzare un campione. In primo luogo, il peptide da analizzare viene disciolto in una matrice, che è un solvente contenente piccole molecole organiche. Queste molecole hanno un alto assorbimento alla lunghezza d'onda del laser. La miscela viene poi lasciata asciugare prima dell'analisi. Questo porta alla formazione di una matrice cristallina che contiene il peptide di interesse. In secondo luogo, la molecola della matrice viene portata a uno stato di energia superiore quando incontra il laser UV. Ciò porta infine alla formazione dello ione di interesse. La molecola ionizzata entra nell'analizzatore di massa e produce lo spettro di massa.
TOF
Il metodo di ionizzazione MALDI è abbinato a un analizzatore di massa chiamato tempo di volo (TOF, dall'inglese "Time Of Flight"). Nel TOF viene misurato il tempo che gli ioni impiegano per raggiungere il rivelatore. La velocità è determinata dal rapporto massa/carica (m/z) dello ione. Dal momento che hanno una massa inferiore, gli ioni più piccoli raggiungeranno il rivelatore prima di quelli più grandi. Anche la carica degli ioni determina la velocità: gli ioni con 2 o più cariche positive si muoveranno più velocemente degli ioni con una sola carica positiva. Quindi, gli ioni più piccoli e con carica positiva si muoveranno più velocemente.
L'output del rivelatore è lo spettro di massa, visualizzato in un "diagramma a bastoncino". Esso mostra la corrente relativa prodotta da ioni con diversi rapporti massa/carica.
Rilevamento delle proteine
Le proteine sono polimeri lineari costituiti da combinazioni dei 20 amminoacidi più comuni, legati tra loro da legami peptidici. La proteina prodotta dai ribosomi subisce una modifica covalente chiamata modifica post-traduzionale. Sono state identificate oltre 200 modifiche.
Il rilevamento della rhEPO è condotto utilizzando uno spettrometro di massa. Il rapporto massa/carica (m/z) è all'incirca uguale alla massa della proteina in Dalton. Per il rilevamento della sostanza si utilizza un campione di urina. Nella maggior parte dei casi, è meglio usare un campione di urina invece del sangue per testare le sostanze proibite. Questo perché la raccolta delle urine non è invasiva e produce un grande volume di campione con una concentrazione di droga più alta rispetto al sangue. Inoltre, l'urina ha meno cellule e proteine che complicherebbero l'estrazione.
Diagramma del glicano che comprende l'unità costitutiva dei monosaccaridi
Per rilevare sostanze proibite nell'urina, bisogna prima ottenere uno spettro standard di urina non contaminata (standard negativo), così come uno della sostanza proibita (standard positivo). Una volta che abbiamo questi due standard, possiamo confrontarli con uno spettro campione. Se lo spettro del campione presenta gli stessi picchi dello standard positivo, possiamo concludere che il campione contiene la sostanza proibita. La spettrometria di massa può anche rilevare la glicosilazione, poiché i dati dello spettrometro di massa vengono elaborati e visualizzati in picchi. Di solito, i picchi di glicosilazione sono contrassegnati da un asterisco o da un diagramma del glicano.
Istogramma nel laboratorio di Labster
Clicca sul pulsante blu per scegliere i dati di spettrometria di massa di rhEPO, espresso in CHO, e E.coli. Ci sono tre grafici:
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Quello a sinistra mostra la massa totale della molecola rilevata. I picchi in questo grafico corrispondono alla massa molecolare di quella particolare proteina.
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Il grafico in alto a destra mostra la panoramica della sequenza peptidica. I picchi in questo grafico rappresentano un aminoacido nella sequenza peptidica.
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Il grafico in basso a destra mostra l'ingrandimento della sequenza peptidica mostrata nel grafico in alto. I picchi in questo grafico rappresentano un aminoacido nella sequenza peptidica. Nota che il diagramma del glicano segna il sito di glicosilazione.