Curva di fusione

L'analisi della curva di fusione è usata per valutare la specificità del test qPCR quando si usano coloranti come il SYBR^®Green.

L'analisi della curva di fusione consiste in una fase supplementare alla fine della qPCR. La temperatura del campione viene aumentata in modo incrementale mentre lo strumento continua a misurare la fluorescenza. Man mano che la temperatura aumenta, il DNA a doppio filamento si denatura, diventando a filamento singolo, e il colorante si dissocia, con conseguente diminuzione della fluorescenza. Il cambiamento di pendenza di questa curva viene poi tracciato in funzione della temperatura per ottenere la curva di fusione. La temperatura di fusione del tuo amplicone è data dalla lunghezza della sequenza e dalla sua composizione di basi. Un test specifico dovrebbe mostrare in modo ottimale un singolo picco di fusione corrispondente a un prodotto PCR specifico (vedi Figura 1). L'analisi della curva di fusione ti permette di vedere se c'è un primer-dimero nella tua qPCR, come indicato dal picco a sinistra del picco principale dell'amplicone nella Figura 2. Un picco dopo il picco principale, anch'esso osservato nella Figura 2, potrebbe indicare un'amplificazione aspecifica (ad esempio la sequenza genomica di questo gene contenente un introne, o un gene simile appartenente alla stessa famiglia genica, ecc.)

Figura 1: Curva di fusione ideale

Figura 2: Curva di fusione con primer-dimero e contaminazione con un frammento di DNA più lungo.

L'analisi della curva di fusione è una verifica importante per l'analisi dei tuoi dati qPCR.