Esperimento di Next Generation Sequencing

Dopo la generazione dei cluster è tutto pronto per iniziare il processo di sequenziamento. Esistono diversi modi per eseguire il Next Generation Sequencing, a seconda della piattaforma che viene utilizzata. In questo laboratorio impieghiamo il sequenziamento per sintesi di Illumina. Ciò implica che i dati di sequenziamento vengono ottenuti sintetizzando ciascuna coppia di basi. Esaminiamo il processo nel dettaglio.

Attacco della polimerasi

Una volta che abbiamo il cluster di DNA clonale attaccato alla flow cell, i reagenti di sequenziamento vengono pompati al suo interno; entrano da un lato della flow cell e fuoriescono dall'altro. Viene immessa la DNA polimerasi T4, che si attacca alle corte molecole di DNA legate alla flow cell. La polimerasi T4 viene modificata per consentire l'incorporazione di una sola base.

Tutti e 4 i nucleotidi vengono marcati con un fluoroforo specifico. Come si può osservare nella Figura 1, la timina è marcata con un fluoroforo verde, la citosina con un fluoroforo blu, la guanina con un fluoroforo rosso e l'adenina con un fluoroforo arancione. Anche questi nucleotidi sono modificati: hanno un cappuccio in posizione 3' che consente solo l'aggiunta di un nucleotide alla volta. Pertanto, dopo che un nucleotide è stato aggiunto all'estremità 3' del primer, nessun altro nucleotide può attaccarsi. Gli eventuali nucleotidi liberi residui vengono eliminati dal sistema tramite lavaggio.

Figura 1: Sequenziamento per sintesi. Dopo che la polimerasi si è attaccata al primer, i nucleotidi marcati con uno specifico fluoroforo verranno aggiunti all'estremità 3' del primer. I nucleotidi sono modificati con un cappuccio in 3', che consente l'aggiunta di un solo nucleotide alla volta. Viene rilevato il segnale fluorescente emesso dal fluoroforo e il cappuccio in 3' viene poi tagliato, consentendo l'inizio del ciclo di sequenziamento successivo.

Nucleotidi marcati con fluoroforo

Rilevamento

Poiché tutti i nucleotidi sono marcati individualmente con uno specifico fluoroforo, possiamo identificarli osservando il segnale di fluorescenza che emettono. Ad esempio, nella Figura 1 possiamo osservare che un nucleotide marcato con un fluoroforo verde è stato aggiunto all'estremità 3' del primer. Una reazione chimica innesca l'emissione della luce verde, che può essere registrata scattando una fotografia. Poiché sappiamo che la timina è marcata col fluoroforo verde, possiamo identificarla in base al suo colore. Alla fine di ogni ciclo vengono scattate quattro immagini, ognuna delle quali registra tutti i possibili colori. Dopo aver scattato tutte e quattro le foto, il sistema le sovrappone. Di conseguenza, possiamo facilmente identificare la combinazione di basi che caratterizza ciascun cluster (vedi Figura 2).

Figura 2: In questa immagine, ottenuta per sovrapposizione, ciascun puntino colorato rappresenta un cluster di DNA amplificato per clonazione. I codici dei colori per i quattro diversi nucleotidi sono: timina (verde), citosina (blu), guanina (rosso) e adenina (arancione).

Scissione ed eliminazione

Dopo aver scattato la fotografia, il cappuccio in 3' del nucleotide viene staccato in modo che possa iniziare il successivo ciclo di sequenziamento. Il cappuccio 3' tagliato viene quindi rimosso dal sistema. Ciò segna la fine di un ciclo di sequenziamento; il ciclo successivo può quindi iniziare, inserendo nuovi nucleotidi e ripetendo ancora i passaggi.

Dopo il sequenziamento, le immagini vengono inserite in un computer e i dati di sequenziamento possono essere analizzati usando un software specifico.